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關于評估首個針對人巨細胞病毒 HCMV 的以核酸擴增 NAT 為基礎的世界衛(wèi)生組織國際標準的協(xié)作研究 CollaborativeStudytoEvaluatetheProposed1stWHOInternationalStandardforHumanCytomegalovirus HCMV forNucleicAcidAmplification NAT BasedAssays余莉 2020 2 23 研究目的 該協(xié)作性研究的目的是通過一系列檢測HCMV的NAT試驗來確定候選標準品的效力評估候選標準品作為二級參考材料校準的合適性以及標化HCMV的病毒載量檢測 2020 2 23 材料 候選標準品的制備 該候選標準品是由原型的臨床HCMV株 Merlin株組成的無細胞游離活病毒制劑 該低傳代株擁有良好的HCMV的特征 與實驗室其他株相比 近似于完整的HCMV基因組 且已完全測序 Genebank登錄號 AY446894 Merlin株為gB1基因型 考慮到用于HCMV檢測樣本來源的多樣性 候選標準品被溶于通用的緩沖液 該緩沖液含有10mM的Tris HCl和人血清白蛋白 然后運用正確的樣本基質(zhì)來進一步稀釋 最后該制劑經(jīng)過冷凍干燥以確保長期穩(wěn)定 2020 2 23 材料 批量樣本的制備 HCMVMerlin毒株的組織上清樣本 P4 在MRC 5細胞內(nèi)增殖 收獲傳至第六代的組織上清液 培養(yǎng)液先低速離心然后超速離心收獲病毒沉淀 病毒沉淀溶于200毫升的含10mM的Tris HCl緩沖液 pH7 4 包含0 5 的人類血清白蛋白 Tris HSA緩沖液 中以制成儲存病毒液 用于候選標準品和其他樣本的人類血清白蛋白為具有生產(chǎn)許可的產(chǎn)品 并經(jīng)過篩選確?？?HIV 1 HBsAg 和丙肝病毒RNA均為陰性 制備好的批量樣本最終容積為6 4LTris HSA的緩沖液 HCMV約為1 107拷貝 毫升 再使用磁力混合攪拌器攪拌30分鐘 取250毫升的批量液體樣本分裝于2毫升的Sarstedt螺釘帽管內(nèi) 每等份1毫升 然后存儲在 80 C 剩下的大部分立即處理成冷凍干燥 是為了準備最終產(chǎn)品 NIBSC代碼09 162 2020 2 23 材料 候選標準品的填充和冷凍干燥 進行填充金屬和塑料的GmbH Radolfzell 德國 負壓隔離器冷凍干燥機 CS15012m2 Serail Arguenteil France Bausch Strobel Ilfshofen 德國 灌裝機FVF5060 2020 2 23 材料 充填后測試 取十二瓶凍干產(chǎn)品評估其剩余水分和氧含量 作為封閉后瓶完整性的指標 剩余水分是由非侵入性的近紅外 NIR 光譜 MCT600P ProcessSensors Corby UK 而定的 氧含量測量使用燈塔紅外線分析儀 FMS 750 LighthouseInstruments Charlottesville USA 為了在協(xié)作研究前確定樣本的均質(zhì)性 取批量液體樣本 n 18 和凍干樣本 n 18 用HCMVrea timePCR進行測試 2020 2 23 材料 冷凍干燥候選樣本的穩(wěn)定性 冷凍干燥的小瓶將溫度保持在 70 C 20 C 4 C 20 C 37 C 45 C 從存儲的各個溫度中取三瓶進行HCMVDNAreal timePCR 如前所述 有限的評估重構產(chǎn)品的穩(wěn)定性 重構產(chǎn)品儲存在 4 C 20 C 37 C HCMVDNAreal timePCR在之后的24和48小時進行 2020 2 23 材料 研究樣本的設置 樣品1 凍干的09 162制品 裝于5mL螺帽玻璃小瓶 樣品2 1毫升冷凍的HCMVMerlin株制品 用于制備凍干的候選樣本 裝于2毫升的Sarstedt螺帽管 樣品3 1毫升冷凍的HCMVAD169全病毒液體 裝于2毫升的Sarstedt螺帽管 樣品4 50 L冷凍的純化BAC 克隆MerlinDNA 裝于0 5毫升的Sarstedt螺帽管 2020 2 23 研究設計 合作研究的目的是為評估候選的HCMV國際標準在一系列基礎NAT試驗中的適用性和效能 四瓶研究樣本1 4通過快遞公司的干冰運輸?shù)絽⑴c的實驗室 按照特定的說明書來存儲和重建 2020 2 23 研究協(xié)議 要求參與者在四個不同的場合使用他們常規(guī)的基礎NAT檢測HCMV 檢驗每個稀釋的樣本 在分開的獨立的實驗中使用新的樣本瓶 將凍干樣品1用1毫升去離子 無核酸酶的水重建 在使用之前至少攪拌20分鐘 研究樣品1 3在使用前已被解凍 震蕩混勻 要求參與者在定量分析的范圍內(nèi)用各自分析中所用的樣本基質(zhì)來稀釋樣品1 3 提取稀釋的每個樣本核酸來擴增 要求參與者在無核酸酶的水中稀釋樣品4 并且取每一個稀釋度的等份樣本直接用于擴增反應 對于定量分析 要求參與者測試至少兩個在線性范圍內(nèi)的連續(xù)10倍稀釋的實驗 要求參與者報告在每個樣本不同的稀釋度中的病毒載量 拷貝 毫升 定性分析用正 負表示 返回結果包括用NIBSC分析的詳細方法 2020 2 23 參與者 研究樣本被送到代表14個國家的32個參與者中 參與者是按照他們在CMVNAT上的經(jīng)驗和地理分布上來選擇的 他們代表主要臨床實驗室 還包括一系列的體外診斷設備制造商 以及參考 研究和質(zhì)量保證實驗室 所有參與的實驗室被編號 隨機分配 而不是按照附錄中的清單代表的順序 2020 2 23 統(tǒng)計學方法 在定量分析中 分析基于參與者提供的結果 報道的結果為 拷貝 毫升 對于每一個試驗運行 每一個樣本獲得一個估計的log10 拷貝 毫升 多個重復樣本取其均值 拷貝 毫升 然后基于不同方法的均數(shù)估算值 拷貝 毫升 來計算實驗室和試驗方法的單個估計值 實驗室間 inter laboratory 的變化用標準差 SD 和 幾何變異系數(shù) GCV 相對于樣本1中不同的效能計算 如果在一個獨立的個體上試驗 測試樣本比候選標準品高0 5log10IU 毫升 候選標準品指定為6 7log10IU 毫升 測試樣品的相對效力為7 2log10IU 毫升 相同的方法被用來計算相對于樣品4的效能 按順序評估純化的DNA使HCMV標準化實驗 2020 2 23 結果和數(shù)據(jù)分析 研究樣本的有效性和穩(wěn)定性評估 候選樣品1的生產(chǎn)數(shù)據(jù)的顯示 質(zhì)量和填充的變異系數(shù)的平均剩余水分是在國際標準可接受范圍內(nèi)的 在NIBSC工作的剩余的氧含量限制是1 1 在NIBSC評價多個整數(shù) n 18 的研究樣本表示 HCMV內(nèi)容的均質(zhì)性與之前研究的全部樣本相似 每個示例2SD小于0 3log10 拷貝 毫升 2020 2 23 結果和數(shù)據(jù)分析 研究樣本的有效性和穩(wěn)定性評估 經(jīng)過考慮 只有差異 0 204儲存8個月的45 C樣本的統(tǒng)計意義重大 原因還不清楚 所有可用的數(shù)據(jù)顯示足夠的穩(wěn)定性 隨后的測試將在12至18個月 然后在2 3 4 5年后進行 2020 2 23 結果和數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)接受 數(shù)據(jù)來自所有的32個參與的實驗室 參與者進行各種各樣的不同的測定方法 一些實驗室執(zhí)行超過一個分析方法 總的來說 數(shù)據(jù)集來自53個定量試驗 5定性試驗 除了下面情況提到的 沒有數(shù)據(jù)的除外 2020 2 23 結果和數(shù)據(jù)分析 總結分析方法 1 大多數(shù)的參與者用血漿或全血來稀釋研究樣品1 3的 然而也有用尿 PBS和無核酸酶水的 稀釋的范圍在每個實驗室之間執(zhí)行的略有不同 抽取主要是自動化 采用一系列的儀器包括 Abbottm2000sp QIAGEN sQIAsymphonySP和RGQ BioRobot MDx和EZ1 bioM rieuxNucliSENS easyMag RocheMagNAPureLC和COBAS AmpliPrep SiemensVERSANT kPCR 手工抽提包括 RocheHighPureViralNucleicAcidKit NanogenEXTRAgen QIAGENQIAamp BloodDNA DNAandViralRNA MiniKits QIAGENQIAampDSPVirusKit Cepheidaffigene DNAExtractionKit以及酚氯仿抽提 2020 2 23 結果和數(shù)據(jù)分析 總結分析方法 2 報告的大多數(shù)數(shù)據(jù)使用的是實時PCR技術 17個參與者使用商業(yè)化分析和試劑 37組數(shù)據(jù) 而13個參與者使用成熟的實驗室方法 17組數(shù)據(jù) 2個參與者同時使用商業(yè)和成熟的實驗室方法 4組數(shù)據(jù) 檢測靶點包含多個HCMV基因 UL122 UL123 MIE IE19 UL54 DNA聚合酶 UL83 pp65 UL55 糖蛋白B US8 HXFL4 UL34和UL80 5 擴增平臺包括 RocheLightCycler 1 5 2 0and480systems COBAS TaqMan andCOBAS AMPLICORAnalyzer AppliedBiosystems 7300 7500 7500Fast and7900HTFastReal TimePCRSystems AgilentMx3000P qPCRSystem QIAGENRotor GeneQ Rotor Gene3000and6000instruments CepheidSmartCycler IIandBio RadMyCycler 考慮到分析組合和變量的范圍 事實上沒有兩個試驗是相似的 除了兩個實驗室使用RocheCOBAS AMPLICORCMVMONITORTest 因此不太可能將根據(jù)方法分組并且根據(jù)方法進行分析 2020 2 23 結果和數(shù)據(jù)分析 估計研究樣本的效能 實驗室對每一個研究樣本的定量分析 log10拷貝 毫升 和定性分析 log10 NAT檢測單位 毫升 的平均估計效能分別見表3 4 各個實驗室對每個試驗和研究樣本的平均估計效能見圖1a d的直方圖 每個盒子代表一個實驗室的平均估計效能 這個盒子上貼有該實驗室的代碼編號 來自于定性試驗的結果用灰色陰影表示 樣品1 3的結果顯示 在不同的試驗中病毒載量被報道有相當大的變化 估計有相差大于2log10 100倍 表5 這些定性試驗的估計通常是低于定量分析的 與此同時 樣品4的變化性大于樣品1 3 雖然這主要是由于從五個不同的試驗結果得來的 圖1d 2020 2 23 圖1 單個實驗室使用定量或定性的NAT試驗所獲得的研究樣本1 4的平均值 每個盒子代表每個實驗室估計的平均值并且貼上實驗室代碼標簽 定性的結果分析用灰色陰影表示 2020 2 23 2020 2 23 2020 2 23 2020 2 23 結果和數(shù)據(jù)分析 估計研究樣本的效能 表5顯示了每個研究樣本的總體估計平均值 包括定量和定性試驗 以及標準差 log10的估計值 和 GCV 實際的估計值 對于樣品1 3 定量分析的標準差大約是0 5log GCV大約是200 定性分析也是相似的 樣品4的標準差和 GCV高于樣品1 3 一大部分原因要歸咎于是無關的結果 2020 2 23 結果和數(shù)據(jù)分析 相對于樣本1的效能 對于每一個定性和定量的試驗 樣品2 4與樣品1的的相對效能單位表示為候選樣本的log10國際單位 毫升 當樣品2和3的平均估計值表達為相對于樣本1時來說 實驗室之間的一致性有很大的提高 而定性的結果有更大的可變性 然而 當樣品4的平均估計值表達為相對于樣本1時 實驗室之間的一致性沒有明顯改善 2020 2 23 圖2 每個定量和定性的試驗的樣品2 4對比樣品1的相對效能 在這兩種情況下單位表示為候選樣本log10單位 毫升 每一個盒子代表每個實驗室測定的相對效能并且貼上該實驗室標簽的代碼 定性分析的結果用灰色陰影表示 2020 2 23 2020 2 23 2020 2 23 結果和數(shù)據(jù)分析 相對于樣本1的效能 這表明使用樣本1作為標準 會顯著減少估計與樣本2 3相似的臨床樣本的HCMV濃度的實驗室間的差異 與對樣品4沒有減少定量測定的標準差 樣本1需要提取 樣本4不需要 對于樣本4 實驗室之間的萃取效率和方法仍然會導致觀察到的實驗室之間的變化 2020 2 23 結果和數(shù)據(jù)分析 相對于樣本4的效能 樣品1 3相對于樣本4的相對效能 定性和定量結果表明 與圖1a c相比較 當純化DNA樣本4被用于校準標準時 實驗室之間的一致性并沒有改善 實驗室之間的標準差已經(jīng)從事實上的約0 5log10增加到0 64log10 而 GCVs增加超過300 這些結果表明 隨著提取純化DNA樣本4不是提取于臨床樣本的 在實驗室之間就無法控制不同提取方法和效率 2020 2 23 圖3 以IU表示的相對于樣品4的樣品1 3估計濃度 樣品4的假設單位量為107國際單位 毫升 每個盒子代表每個實驗室的相對效能并且貼上該實驗室編號標記 定性結果分析用灰色陰影表示 2020 2 23 2020 2 23 2020 2 23 實驗室內(nèi)部的變化 表12顯示了每一個實驗室的實驗室內(nèi)部的標準差和 GCVs 計算時將樣本1 3的估計混合 但樣本4是獨立計算 對于所有樣品 實驗室之間變異都大于實驗室內(nèi)部的變化 p 0 0001 對于樣本1 3 估計實驗室試驗的重復性之間有差異 一般說來平均標準差為0 11log10 GCV為30 對于樣本4 實驗室之間有更大范圍值的變化 平均標準差為0 21log10而 GCV為63 2020 2 23 結論 這項研究的結果表明NIBSC NationalInstituteforBiologicalStandardsandControl 世界衛(wèi)生組織屬下的國際生物標準和控制研究所 代碼09 162候選標準品適合用作基于NAT的HCMVDNA定量試驗 該標準品被推薦為首個針對HCMV的WHO國際標準 賦值的國際單位是專斷的 5 106國際單位被選作代表候選標準品對所有分析的一致性估計值 2020 2 23 建議 候選標準品 NIBSC代碼09 162 作為HCMV國際標準品 當其在1毫升無核酸酶的水中重構時 指定的效能5 106國際單位 該標準旨在供臨床使用實驗室和體外試管制造商用于常規(guī)以NAT為基礎的二次引用HCMV校準試驗