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關(guān)于評(píng)估首個(gè)針對(duì)人巨細(xì)胞病毒 HCMV 的以核酸擴(kuò)增 NAT 為基礎(chǔ)的世界衛(wèi)生組織國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)的協(xié)作研究 CollaborativeStudytoEvaluatetheProposed1stWHOInternationalStandardforHumanCytomegalovirus HCMV forNucleicAcidAmplification NAT BasedAssays余莉 2020 2 23 研究目的 該協(xié)作性研究的目的是通過(guò)一系列檢測(cè)HCMV的NAT試驗(yàn)來(lái)確定候選標(biāo)準(zhǔn)品的效力評(píng)估候選標(biāo)準(zhǔn)品作為二級(jí)參考材料校準(zhǔn)的合適性以及標(biāo)化HCMV的病毒載量檢測(cè) 2020 2 23 材料 候選標(biāo)準(zhǔn)品的制備 該候選標(biāo)準(zhǔn)品是由原型的臨床HCMV株 Merlin株組成的無(wú)細(xì)胞游離活病毒制劑 該低傳代株擁有良好的HCMV的特征 與實(shí)驗(yàn)室其他株相比 近似于完整的HCMV基因組 且已完全測(cè)序 Genebank登錄號(hào) AY446894 Merlin株為gB1基因型 考慮到用于HCMV檢測(cè)樣本來(lái)源的多樣性 候選標(biāo)準(zhǔn)品被溶于通用的緩沖液 該緩沖液含有10mM的Tris HCl和人血清白蛋白 然后運(yùn)用正確的樣本基質(zhì)來(lái)進(jìn)一步稀釋 最后該制劑經(jīng)過(guò)冷凍干燥以確保長(zhǎng)期穩(wěn)定 2020 2 23 材料 批量樣本的制備 HCMVMerlin毒株的組織上清樣本 P4 在MRC 5細(xì)胞內(nèi)增殖 收獲傳至第六代的組織上清液 培養(yǎng)液先低速離心然后超速離心收獲病毒沉淀 病毒沉淀溶于200毫升的含10mM的Tris HCl緩沖液 pH7 4 包含0 5 的人類血清白蛋白 Tris HSA緩沖液 中以制成儲(chǔ)存病毒液 用于候選標(biāo)準(zhǔn)品和其他樣本的人類血清白蛋白為具有生產(chǎn)許可的產(chǎn)品 并經(jīng)過(guò)篩選確?？?HIV 1 HBsAg 和丙肝病毒RNA均為陰性 制備好的批量樣本最終容積為6 4LTris HSA的緩沖液 HCMV約為1 107拷貝 毫升 再使用磁力混合攪拌器攪拌30分鐘 取250毫升的批量液體樣本分裝于2毫升的Sarstedt螺釘帽管內(nèi) 每等份1毫升 然后存儲(chǔ)在 80 C 剩下的大部分立即處理成冷凍干燥 是為了準(zhǔn)備最終產(chǎn)品 NIBSC代碼09 162 2020 2 23 材料 候選標(biāo)準(zhǔn)品的填充和冷凍干燥 進(jìn)行填充金屬和塑料的GmbH Radolfzell 德國(guó) 負(fù)壓隔離器冷凍干燥機(jī) CS15012m2 Serail Arguenteil France Bausch Strobel Ilfshofen 德國(guó) 灌裝機(jī)FVF5060 2020 2 23 材料 充填后測(cè)試 取十二瓶?jī)龈僧a(chǎn)品評(píng)估其剩余水分和氧含量 作為封閉后瓶完整性的指標(biāo) 剩余水分是由非侵入性的近紅外 NIR 光譜 MCT600P ProcessSensors Corby UK 而定的 氧含量測(cè)量使用燈塔紅外線分析儀 FMS 750 LighthouseInstruments Charlottesville USA 為了在協(xié)作研究前確定樣本的均質(zhì)性 取批量液體樣本 n 18 和凍干樣本 n 18 用HCMVrea timePCR進(jìn)行測(cè)試 2020 2 23 材料 冷凍干燥候選樣本的穩(wěn)定性 冷凍干燥的小瓶將溫度保持在 70 C 20 C 4 C 20 C 37 C 45 C 從存儲(chǔ)的各個(gè)溫度中取三瓶進(jìn)行HCMVDNAreal timePCR 如前所述 有限的評(píng)估重構(gòu)產(chǎn)品的穩(wěn)定性 重構(gòu)產(chǎn)品儲(chǔ)存在 4 C 20 C 37 C HCMVDNAreal timePCR在之后的24和48小時(shí)進(jìn)行 2020 2 23 材料 研究樣本的設(shè)置 樣品1 凍干的09 162制品 裝于5mL螺帽玻璃小瓶 樣品2 1毫升冷凍的HCMVMerlin株制品 用于制備凍干的候選樣本 裝于2毫升的Sarstedt螺帽管 樣品3 1毫升冷凍的HCMVAD169全病毒液體 裝于2毫升的Sarstedt螺帽管 樣品4 50 L冷凍的純化BAC 克隆MerlinDNA 裝于0 5毫升的Sarstedt螺帽管 2020 2 23 研究設(shè)計(jì) 合作研究的目的是為評(píng)估候選的HCMV國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)在一系列基礎(chǔ)NAT試驗(yàn)中的適用性和效能 四瓶研究樣本1 4通過(guò)快遞公司的干冰運(yùn)輸?shù)絽⑴c的實(shí)驗(yàn)室 按照特定的說(shuō)明書(shū)來(lái)存儲(chǔ)和重建 2020 2 23 研究協(xié)議 要求參與者在四個(gè)不同的場(chǎng)合使用他們常規(guī)的基礎(chǔ)NAT檢測(cè)HCMV 檢驗(yàn)每個(gè)稀釋的樣本 在分開(kāi)的獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中使用新的樣本瓶 將凍干樣品1用1毫升去離子 無(wú)核酸酶的水重建 在使用之前至少攪拌20分鐘 研究樣品1 3在使用前已被解凍 震蕩混勻 要求參與者在定量分析的范圍內(nèi)用各自分析中所用的樣本基質(zhì)來(lái)稀釋樣品1 3 提取稀釋的每個(gè)樣本核酸來(lái)擴(kuò)增 要求參與者在無(wú)核酸酶的水中稀釋樣品4 并且取每一個(gè)稀釋度的等份樣本直接用于擴(kuò)增反應(yīng) 對(duì)于定量分析 要求參與者測(cè)試至少兩個(gè)在線性范圍內(nèi)的連續(xù)10倍稀釋的實(shí)驗(yàn) 要求參與者報(bào)告在每個(gè)樣本不同的稀釋度中的病毒載量 拷貝 毫升 定性分析用正 負(fù)表示 返回結(jié)果包括用NIBSC分析的詳細(xì)方法 2020 2 23 參與者 研究樣本被送到代表14個(gè)國(guó)家的32個(gè)參與者中 參與者是按照他們?cè)贑MVNAT上的經(jīng)驗(yàn)和地理分布上來(lái)選擇的 他們代表主要臨床實(shí)驗(yàn)室 還包括一系列的體外診斷設(shè)備制造商 以及參考 研究和質(zhì)量保證實(shí)驗(yàn)室 所有參與的實(shí)驗(yàn)室被編號(hào) 隨機(jī)分配 而不是按照附錄中的清單代表的順序 2020 2 23 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 在定量分析中 分析基于參與者提供的結(jié)果 報(bào)道的結(jié)果為 拷貝 毫升 對(duì)于每一個(gè)試驗(yàn)運(yùn)行 每一個(gè)樣本獲得一個(gè)估計(jì)的log10 拷貝 毫升 多個(gè)重復(fù)樣本取其均值 拷貝 毫升 然后基于不同方法的均數(shù)估算值 拷貝 毫升 來(lái)計(jì)算實(shí)驗(yàn)室和試驗(yàn)方法的單個(gè)估計(jì)值 實(shí)驗(yàn)室間 inter laboratory 的變化用標(biāo)準(zhǔn)差 SD 和 幾何變異系數(shù) GCV 相對(duì)于樣本1中不同的效能計(jì)算 如果在一個(gè)獨(dú)立的個(gè)體上試驗(yàn) 測(cè)試樣本比候選標(biāo)準(zhǔn)品高0 5log10IU 毫升 候選標(biāo)準(zhǔn)品指定為6 7log10IU 毫升 測(cè)試樣品的相對(duì)效力為7 2log10IU 毫升 相同的方法被用來(lái)計(jì)算相對(duì)于樣品4的效能 按順序評(píng)估純化的DNA使HCMV標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn) 2020 2 23 結(jié)果和數(shù)據(jù)分析 研究樣本的有效性和穩(wěn)定性評(píng)估 候選樣品1的生產(chǎn)數(shù)據(jù)的顯示 質(zhì)量和填充的變異系數(shù)的平均剩余水分是在國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)可接受范圍內(nèi)的 在NIBSC工作的剩余的氧含量限制是1 1 在NIBSC評(píng)價(jià)多個(gè)整數(shù) n 18 的研究樣本表示 HCMV內(nèi)容的均質(zhì)性與之前研究的全部樣本相似 每個(gè)示例2SD小于0 3log10 拷貝 毫升 2020 2 23 結(jié)果和數(shù)據(jù)分析 研究樣本的有效性和穩(wěn)定性評(píng)估 經(jīng)過(guò)考慮 只有差異 0 204儲(chǔ)存8個(gè)月的45 C樣本的統(tǒng)計(jì)意義重大 原因還不清楚 所有可用的數(shù)據(jù)顯示足夠的穩(wěn)定性 隨后的測(cè)試將在12至18個(gè)月 然后在2 3 4 5年后進(jìn)行 2020 2 23 結(jié)果和數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)接受 數(shù)據(jù)來(lái)自所有的32個(gè)參與的實(shí)驗(yàn)室 參與者進(jìn)行各種各樣的不同的測(cè)定方法 一些實(shí)驗(yàn)室執(zhí)行超過(guò)一個(gè)分析方法 總的來(lái)說(shuō) 數(shù)據(jù)集來(lái)自53個(gè)定量試驗(yàn) 5定性試驗(yàn) 除了下面情況提到的 沒(méi)有數(shù)據(jù)的除外 2020 2 23 結(jié)果和數(shù)據(jù)分析 總結(jié)分析方法 1 大多數(shù)的參與者用血漿或全血來(lái)稀釋研究樣品1 3的 然而也有用尿 PBS和無(wú)核酸酶水的 稀釋的范圍在每個(gè)實(shí)驗(yàn)室之間執(zhí)行的略有不同 抽取主要是自動(dòng)化 采用一系列的儀器包括 Abbottm2000sp QIAGEN sQIAsymphonySP和RGQ BioRobot MDx和EZ1 bioM rieuxNucliSENS easyMag RocheMagNAPureLC和COBAS AmpliPrep SiemensVERSANT kPCR 手工抽提包括 RocheHighPureViralNucleicAcidKit NanogenEXTRAgen QIAGENQIAamp BloodDNA DNAandViralRNA MiniKits QIAGENQIAampDSPVirusKit Cepheidaffigene DNAExtractionKit以及酚氯仿抽提 2020 2 23 結(jié)果和數(shù)據(jù)分析 總結(jié)分析方法 2 報(bào)告的大多數(shù)數(shù)據(jù)使用的是實(shí)時(shí)PCR技術(shù) 17個(gè)參與者使用商業(yè)化分析和試劑 37組數(shù)據(jù) 而13個(gè)參與者使用成熟的實(shí)驗(yàn)室方法 17組數(shù)據(jù) 2個(gè)參與者同時(shí)使用商業(yè)和成熟的實(shí)驗(yàn)室方法 4組數(shù)據(jù) 檢測(cè)靶點(diǎn)包含多個(gè)HCMV基因 UL122 UL123 MIE IE19 UL54 DNA聚合酶 UL83 pp65 UL55 糖蛋白B US8 HXFL4 UL34和UL80 5 擴(kuò)增平臺(tái)包括 RocheLightCycler 1 5 2 0and480systems COBAS TaqMan andCOBAS AMPLICORAnalyzer AppliedBiosystems 7300 7500 7500Fast and7900HTFastReal TimePCRSystems AgilentMx3000P qPCRSystem QIAGENRotor GeneQ Rotor Gene3000and6000instruments CepheidSmartCycler IIandBio RadMyCycler 考慮到分析組合和變量的范圍 事實(shí)上沒(méi)有兩個(gè)試驗(yàn)是相似的 除了兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室使用RocheCOBAS AMPLICORCMVMONITORTest 因此不太可能將根據(jù)方法分組并且根據(jù)方法進(jìn)行分析 2020 2 23 結(jié)果和數(shù)據(jù)分析 估計(jì)研究樣本的效能 實(shí)驗(yàn)室對(duì)每一個(gè)研究樣本的定量分析 log10拷貝 毫升 和定性分析 log10 NAT檢測(cè)單位 毫升 的平均估計(jì)效能分別見(jiàn)表3 4 各個(gè)實(shí)驗(yàn)室對(duì)每個(gè)試驗(yàn)和研究樣本的平均估計(jì)效能見(jiàn)圖1a d的直方圖 每個(gè)盒子代表一個(gè)實(shí)驗(yàn)室的平均估計(jì)效能 這個(gè)盒子上貼有該實(shí)驗(yàn)室的代碼編號(hào) 來(lái)自于定性試驗(yàn)的結(jié)果用灰色陰影表示 樣品1 3的結(jié)果顯示 在不同的試驗(yàn)中病毒載量被報(bào)道有相當(dāng)大的變化 估計(jì)有相差大于2log10 100倍 表5 這些定性試驗(yàn)的估計(jì)通常是低于定量分析的 與此同時(shí) 樣品4的變化性大于樣品1 3 雖然這主要是由于從五個(gè)不同的試驗(yàn)結(jié)果得來(lái)的 圖1d 2020 2 23 圖1 單個(gè)實(shí)驗(yàn)室使用定量或定性的NAT試驗(yàn)所獲得的研究樣本1 4的平均值 每個(gè)盒子代表每個(gè)實(shí)驗(yàn)室估計(jì)的平均值并且貼上實(shí)驗(yàn)室代碼標(biāo)簽 定性的結(jié)果分析用灰色陰影表示 2020 2 23 2020 2 23 2020 2 23 2020 2 23 結(jié)果和數(shù)據(jù)分析 估計(jì)研究樣本的效能 表5顯示了每個(gè)研究樣本的總體估計(jì)平均值 包括定量和定性試驗(yàn) 以及標(biāo)準(zhǔn)差 log10的估計(jì)值 和 GCV 實(shí)際的估計(jì)值 對(duì)于樣品1 3 定量分析的標(biāo)準(zhǔn)差大約是0 5log GCV大約是200 定性分析也是相似的 樣品4的標(biāo)準(zhǔn)差和 GCV高于樣品1 3 一大部分原因要?dú)w咎于是無(wú)關(guān)的結(jié)果 2020 2 23 結(jié)果和數(shù)據(jù)分析 相對(duì)于樣本1的效能 對(duì)于每一個(gè)定性和定量的試驗(yàn) 樣品2 4與樣品1的的相對(duì)效能單位表示為候選樣本的log10國(guó)際單位 毫升 當(dāng)樣品2和3的平均估計(jì)值表達(dá)為相對(duì)于樣本1時(shí)來(lái)說(shuō) 實(shí)驗(yàn)室之間的一致性有很大的提高 而定性的結(jié)果有更大的可變性 然而 當(dāng)樣品4的平均估計(jì)值表達(dá)為相對(duì)于樣本1時(shí) 實(shí)驗(yàn)室之間的一致性沒(méi)有明顯改善 2020 2 23 圖2 每個(gè)定量和定性的試驗(yàn)的樣品2 4對(duì)比樣品1的相對(duì)效能 在這兩種情況下單位表示為候選樣本log10單位 毫升 每一個(gè)盒子代表每個(gè)實(shí)驗(yàn)室測(cè)定的相對(duì)效能并且貼上該實(shí)驗(yàn)室標(biāo)簽的代碼 定性分析的結(jié)果用灰色陰影表示 2020 2 23 2020 2 23 2020 2 23 結(jié)果和數(shù)據(jù)分析 相對(duì)于樣本1的效能 這表明使用樣本1作為標(biāo)準(zhǔn) 會(huì)顯著減少估計(jì)與樣本2 3相似的臨床樣本的HCMV濃度的實(shí)驗(yàn)室間的差異 與對(duì)樣品4沒(méi)有減少定量測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)差 樣本1需要提取 樣本4不需要 對(duì)于樣本4 實(shí)驗(yàn)室之間的萃取效率和方法仍然會(huì)導(dǎo)致觀察到的實(shí)驗(yàn)室之間的變化 2020 2 23 結(jié)果和數(shù)據(jù)分析 相對(duì)于樣本4的效能 樣品1 3相對(duì)于樣本4的相對(duì)效能 定性和定量結(jié)果表明 與圖1a c相比較 當(dāng)純化DNA樣本4被用于校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)時(shí) 實(shí)驗(yàn)室之間的一致性并沒(méi)有改善 實(shí)驗(yàn)室之間的標(biāo)準(zhǔn)差已經(jīng)從事實(shí)上的約0 5log10增加到0 64log10 而 GCVs增加超過(guò)300 這些結(jié)果表明 隨著提取純化DNA樣本4不是提取于臨床樣本的 在實(shí)驗(yàn)室之間就無(wú)法控制不同提取方法和效率 2020 2 23 圖3 以IU表示的相對(duì)于樣品4的樣品1 3估計(jì)濃度 樣品4的假設(shè)單位量為107國(guó)際單位 毫升 每個(gè)盒子代表每個(gè)實(shí)驗(yàn)室的相對(duì)效能并且貼上該實(shí)驗(yàn)室編號(hào)標(biāo)記 定性結(jié)果分析用灰色陰影表示 2020 2 23 2020 2 23 2020 2 23 實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部的變化 表12顯示了每一個(gè)實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部的標(biāo)準(zhǔn)差和 GCVs 計(jì)算時(shí)將樣本1 3的估計(jì)混合 但樣本4是獨(dú)立計(jì)算 對(duì)于所有樣品 實(shí)驗(yàn)室之間變異都大于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部的變化 p 0 0001 對(duì)于樣本1 3 估計(jì)實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)的重復(fù)性之間有差異 一般說(shuō)來(lái)平均標(biāo)準(zhǔn)差為0 11log10 GCV為30 對(duì)于樣本4 實(shí)驗(yàn)室之間有更大范圍值的變化 平均標(biāo)準(zhǔn)差為0 21log10而 GCV為63 2020 2 23 結(jié)論 這項(xiàng)研究的結(jié)果表明NIBSC NationalInstituteforBiologicalStandardsandControl 世界衛(wèi)生組織屬下的國(guó)際生物標(biāo)準(zhǔn)和控制研究所 代碼09 162候選標(biāo)準(zhǔn)品適合用作基于NAT的HCMVDNA定量試驗(yàn) 該標(biāo)準(zhǔn)品被推薦為首個(gè)針對(duì)HCMV的WHO國(guó)際標(biāo)準(zhǔn) 賦值的國(guó)際單位是專斷的 5 106國(guó)際單位被選作代表候選標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)所有分析的一致性估計(jì)值 2020 2 23 建議 候選標(biāo)準(zhǔn)品 NIBSC代碼09 162 作為HCMV國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品 當(dāng)其在1毫升無(wú)核酸酶的水中重構(gòu)時(shí) 指定的效能5 106國(guó)際單位 該標(biāo)準(zhǔn)旨在供臨床使用實(shí)驗(yàn)室和體外試管制造商用于常規(guī)以NAT為基礎(chǔ)的二次引用HCMV校準(zhǔn)試驗(yàn)