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.,發(fā)酵車間培訓(xùn)資料,生產(chǎn)二部 2017.06.12,.,第一部分 意識的培養(yǎng),我們的發(fā)酵屬于純培養(yǎng)，是由單一菌種接種以 后進(jìn)行的培養(yǎng)，其中不可以有任何雜菌，否則會影 響發(fā)酵的成敗及產(chǎn)品的使用效果，所以為了確保每一批發(fā)酵的成功，在生產(chǎn)過程中菌種、發(fā)酵人員必須具備以下兩種意識： 無菌意識 由于微生物個體小、分布廣泛等特性，發(fā)酵染菌 的途徑有很多，而且如果染菌的話，我們無法及時 做出判斷，必須培養(yǎng)一段時間才能看出來，發(fā)現(xiàn)以 后的結(jié)果只能是重消、提前放罐或倒罐，造成不小的損失，所以生產(chǎn)過程中每一個環(huán)節(jié)都必須具備無菌意識，每一步操作都按照操作規(guī)程進(jìn)行，抓住每一個細(xì)節(jié)，才能確保不會染菌。 無菌意識是每一個菌種、發(fā)酵、生測人員具有的意識。,.,2、安全意識 空氣壓力能達(dá)到0.25~0.3MPa；正常供氣壓力0.15-0.2MPa，（儀表用空氣注意減壓）；空氣溫度：50+5℃ 蒸汽壓力0.4-0.6MPa以上，防止壓力過高擊穿墊片、閥門等 設(shè)備用電；（本崗位熟練人員操作、防水...維修必須專業(yè)電工進(jìn)行） 機械攪拌；（設(shè)備檢修必須切斷電源且有明顯的標(biāo)識牌、高速離心設(shè)備注意平衡及緊鎖裝置） 酸堿、易燃易爆、粉塵：防護(hù)措施及應(yīng)急措施。 ⑤ 進(jìn)罐檢查：切點電源、明顯標(biāo)識牌、有人值守 ⑥ 人員著裝 ⑦ 發(fā)酵罐：空消、實消等加熱狀態(tài)打開夾套排污閥，防止夾套或內(nèi)壁損毀；移種、放罐升高壓力后，不能同時關(guān)閉進(jìn)氣、排氣閥門，防止罐內(nèi)產(chǎn)生負(fù)壓。,.,第二部分、發(fā)酵罐罐體管道結(jié)構(gòu)介紹,空氣路：培養(yǎng)過程中向罐內(nèi)通無菌空氣 蒸汽管路 物料管路：配料管路、補料管路 取樣路：培養(yǎng)過程中取樣監(jiān)控菌體生長情況 尾氣路：排氣（大排氣、小排氣） 出料路：移種、放罐 夾套進(jìn)水路：冷凍水、循環(huán)水、熱水（蒸汽） 夾套回水路：冷凍水、循環(huán)水、熱水（蒸汽） 排污管路,.,.,各種圖形、顏色代表的意義,.,.,第三部分、發(fā)酵基本操作過程,.,第一：罐檢 目的：快速檢查發(fā)酵罐，確保發(fā)酵罐正常，可以上罐。 檢查項目： 閥門：所有閥門是否能正常使用、是否處于正確的位置。 壓力表：壓力表是否歸零。 PH和溶氧電極：電極是否拔出并正確保養(yǎng)。 罐體：罐內(nèi)是否清洗干凈。 攪拌電機：點動電機，看電機運轉(zhuǎn)是否正常。 攪拌葉輪、消泡裝置是否緊固，有無松動等。 第二：空消 空消主要目的是在進(jìn)罐生產(chǎn)前對設(shè)備清潔和殺滅其他微生物，防止因設(shè)備清潔不徹底或設(shè)備停用時間過久，微生物滋生，從而對生產(chǎn)造成影響。 1、放罐后及時清洗空消。 2、長期不用罐或更換品種、染菌罐需空消。 3、空消之后無菌空氣保壓待用。,.,空消操作流程,.,第三、電極標(biāo)定 目的：為了確保電極準(zhǔn)確測量，必須在使用前對電極進(jìn)行標(biāo)定。 注意事項： 新電極或放置很久的電極必須激活以后才可以進(jìn)行標(biāo)定和使用。PH電極用3moL/L的KCl溶液浸泡6小時激活，溶氧電極通電6小時激活。 PH電極標(biāo)定的時候需要將接地電極放入盛放標(biāo)準(zhǔn)液的燒杯內(nèi)。 接種以后設(shè)定好發(fā)酵參數(shù)，然后進(jìn)行溶氧電極百分百標(biāo)定。,.,電極標(biāo)定參數(shù)：,.,第四：配料 增容： 實消過程中部分蒸汽會冷凝形成冷凝水進(jìn)入 培養(yǎng)基中，從而導(dǎo)致培養(yǎng)基體積變大，變大的部分 即為增容。不同的地區(qū)，不同的氣候，不同的產(chǎn)品品種及原料增容量都會不同的，需要通過多次實消滅菌總結(jié)才能得到一個經(jīng)驗值。10-30% 領(lǐng)料：正確填寫領(lǐng)料單，從倉庫領(lǐng)料，并從領(lǐng)料單簽字確認(rèn)。 溶料：按工藝要求順序溶解各種原料； 原料全部溶解，無雜質(zhì)、無硬塊。 投料：確認(rèn)電極已經(jīng)安裝上，出料一閥已經(jīng)關(guān)閉。 考慮增容和種子體積，定容到發(fā)酵消前體積。,.,第五：實消 發(fā)酵罐實消是對發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行徹底的滅菌處理, 利用高溫過飽和蒸汽的強穿透能力使各種細(xì)菌、真菌蛋白質(zhì)凝固而死亡。實消結(jié)束以后罐內(nèi)是無菌的環(huán)境，需通入無菌空氣進(jìn)行保壓直到培養(yǎng)結(jié)束。 實消操作流程預(yù)熱：打開夾套排污，用蒸汽進(jìn)行預(yù)熱 當(dāng)溫度達(dá)到90度以上停止預(yù)熱，關(guān)閉攪拌。升溫：三路進(jìn)汽；當(dāng)壓力升到0.05MP a時打開所有 和罐體連接的排汽閥門，消毒過程不得有消毒死角。保壓：調(diào)節(jié)三路進(jìn)氣及排汽，常規(guī)滅菌保壓過程：溫度121 壓力0.12 30分鐘滅菌結(jié)束：保壓結(jié)束先關(guān)閉各小排氣及取樣、放料管路進(jìn)汽，待罐壓低于精過濾器壓力后，快速關(guān)閉空氣管路蒸汽閥門，打開空氣閥門，調(diào)整進(jìn)氣、排氣閥門，保持罐壓0.05-0.1MPa；降溫：開啟冷卻水降溫至工藝要求溫度，降溫過程注意罐壓，防止罐壓掉零。,.,消毒過程中的注意事項 1、首先要結(jié)合配料工共同確認(rèn)本批罐所用的原料為合格品，發(fā)現(xiàn)有結(jié)塊、變質(zhì)的原料不得使用。 2、在用泵向罐中打配制好的培養(yǎng)基時要注意保持稍開些進(jìn)氣，讓料翻騰，以防（前期）培養(yǎng)基濃度過大沉淀粘附在罐底、結(jié)塊等。 3、打完料后首先調(diào)至適宜的PH，再確認(rèn)一下所有的培養(yǎng)基都已加入后封住罐口，開始從進(jìn)氣口、放料口、取樣口等分路進(jìn)入蒸汽。各路保持均衡進(jìn)汽，防止短路 和堵塞，排氣要暢通，排汽量不宜過大，以節(jié)約蒸汽。 4、在實消過程中要保持壓力的穩(wěn)定，不宜突然卸壓升壓以防造成大量泡沫冒頂或逃料。 5、在實消控制時原則上以溫度為準(zhǔn)，壓力為輔。但是在保壓時可能出現(xiàn)壓力表與溫度計不對應(yīng)的情況， 在不能確定到底是溫度計還是壓力表失靈時，當(dāng)壓力表顯示壓力大于等于0.1Mpa,而溫度不到121℃時，以溫度計為準(zhǔn)；反之，則以壓力表為準(zhǔn) ，總之要確保壓力與溫度都達(dá)到滅菌要求。,.,6、如遇蒸汽壓力突然升高，罐溫超過規(guī)定，可適當(dāng)縮短滅菌時間；如遇蒸汽壓力突然下跌，一時上不來，溫度下降到規(guī)定范圍以下，可適當(dāng)延長滅菌時間，以確保滅菌徹底。嚴(yán)防高溫高壓悶罐，否則容易造成培養(yǎng)基成分破壞和PH值升高。 7、在實消結(jié)束降溫時在確定空氣過濾器的壓力大于罐壓時，可以先打開空氣進(jìn)氣閥，再開冷卻水閥以防外界空氣倒吸進(jìn)去。 8、在降溫過程中嚴(yán)防大開排氣閥使罐壓幾乎跌零，特別是種子罐裝料系數(shù)較大，這樣做會使料液翻騰劇烈產(chǎn)生大量的泡沫，易出現(xiàn)冒頂或逃料。 9、在消移種管道時要確保整個管道打氣暢通，嚴(yán)防堵塞 或排氣不暢。在消好后，通入無菌空氣（即給管道降溫又能使管道內(nèi)保持正壓）。 10、移種結(jié)束后要把發(fā)酵罐調(diào)至正常培養(yǎng)狀態(tài)并交工藝控制人員；填寫移種記錄；移種后對移種管道消毒，吹盡管道內(nèi)參與種液，放置殘余種液在管道內(nèi)滋生。,.,第六、接種 接種方法：壓差接種法 接種材料：種子液、火焰圈、95%酒精、酒精棉、鑷子、打火機、石棉手套 注意事項： 環(huán)境：關(guān)閉車間門窗和排氣扇，接種環(huán)境周圍禁止人員來回走動，降低空氣流動性；關(guān)掉攪拌。 無菌：拔接種針護(hù)套時需靠在火焰附近，接種壺不可傾斜過度，避免種子液流出；接種操作過程中罐壓不能掉零； 安全：罐壓不可過高，防止接種管爆裂或脫落，接種失??； 接種之前要確認(rèn)種子與罐的對應(yīng)關(guān)系，防止接錯種子。,.,第七、工藝控制與記錄 1、記錄 每間隔1小時記錄一次參數(shù)； 主要參數(shù)有PH值、風(fēng)量、轉(zhuǎn)速、溶氧值、溫度、壓力和、補料量、備注等。 取樣 依據(jù)工藝要求按時取樣送交化驗部并做好鏡檢工作。 取樣前后的消毒、廢液的收集處理 3.工藝控制 根據(jù)工藝參數(shù)（如溶氧、PH）的變化和檢測（糖、氮、OD、目的產(chǎn)物等）結(jié)果，對工藝參數(shù)進(jìn)行調(diào)整控制。 設(shè)備巡查 檢查攪拌電機，看電機有沒有異響、過熱等； 檢查酸堿罐、消泡罐和補料罐裝液量，及時補充； 檢查管道、閥門，看有無外漏。,.,第八：放罐 達(dá)到工藝放罐標(biāo)準(zhǔn)條件即可放罐，放罐操作流程如下： 提前通知后提取車間準(zhǔn)備放罐 取樣（常溫保存和低溫保存） 蒸汽消毒放罐管道 檢查管道閥門 升壓 放罐 吹洗放料管道內(nèi)殘余料液。 填寫記錄表格（放罐體積、工藝技術(shù)指標(biāo)等） 第九：洗罐 放罐結(jié)束以后立即進(jìn)行洗罐，洗罐流程如下： 卸壓：打開罐蓋前要先卸掉罐壓； 電極保養(yǎng)：拔出電極清洗干凈以后進(jìn)行正確保養(yǎng)； PH電極用3摩爾每升的KCl溶液浸泡電極頭； 溶氧電極直接通電。 沖洗罐壁：用高壓水槍沖洗罐壁，如果罐壁培養(yǎng)基沖洗不掉則考慮堿煮（5%的堿液用夾套升溫到80℃以后保溫30分鐘）； 排污：排掉污水。,.,第十、檢修 目的：確保閥門、法蘭、機械密封和試鏡燈等不會泄漏，以備下批生產(chǎn)使用； 方法：罐體通入空氣保壓在0.15MPa，然后用肥皂水進(jìn)行試漏，出現(xiàn)泄漏的閥門待壓力卸掉以后進(jìn)行檢修，更換相應(yīng)的墊片。,.,第四部分 染菌的發(fā)生、原因分析及防治 發(fā)酵工業(yè)自從采用純種培養(yǎng)以后，產(chǎn)率有了很大提高，然而防止染菌的要求也更高了。染菌是發(fā)酵工業(yè)的致命傷，輕者影響產(chǎn)率、提取收率、產(chǎn)品質(zhì)量和三廢治理，嚴(yán)重者造成倒罐，浪費大量原材料，造成嚴(yán)重經(jīng)濟損失，而且擾亂生產(chǎn)秩序，破壞生產(chǎn)計劃。 在發(fā)酵染菌之后，必須分析染菌原因，總結(jié)發(fā)酵染菌的經(jīng)驗教訓(xùn)，把發(fā)酵染菌消滅在發(fā)生之前，防患于未然，是積極制服發(fā)酵染菌的最重要措施。 一、不同染菌時間對發(fā)酵的影響 1、種子培養(yǎng)期染菌 種子培養(yǎng)主要是生長繁殖菌體，菌體濃度低，培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富，比較容易染菌，帶進(jìn)發(fā)酵罐中危害極大，應(yīng)嚴(yán)格控制種子污染。當(dāng)發(fā)現(xiàn)種子染菌均應(yīng)滅菌后倒入地溝，并對種子罐、管道進(jìn)行檢查和徹底滅菌。 2、發(fā)酵前期染菌 發(fā)酵前期主要是菌體生長繁殖，代謝產(chǎn)物較少，這個時期容易染菌，一旦污染雜菌會迅速繁殖，與生產(chǎn)菌爭奪營養(yǎng)成分和氧分，嚴(yán)重干擾生產(chǎn)菌的生長繁殖和產(chǎn)物的生成，要特別防止發(fā)酵前期染菌。緊急處理措施：如果污染危害較大的雜菌不能繼續(xù)運轉(zhuǎn)，必須重新滅菌。重滅前可適當(dāng)放出部分發(fā)酵液，并補入適量的培養(yǎng)基特別是氮源使消后的培養(yǎng)基符合發(fā)酵要求，滅后調(diào)節(jié)好PH后重新移種或倒種。,.,如果污染的雜菌無大的影響，可以繼續(xù)運轉(zhuǎn)，但要密切注意發(fā)酵過程的代謝情況和雜菌的變化，必要時可適當(dāng)降低罐溫、空氣流量、和控制補料量進(jìn)行發(fā)酵。 3、發(fā)酵中期染菌 發(fā)酵中期染菌將嚴(yán)重干擾生產(chǎn)菌的代謝，影響產(chǎn)物的生成。有些雜菌繁殖后產(chǎn)生酸性或堿性物質(zhì)，使PH值異常變化加堿突增或驟減，糖、氮消耗迅速，菌體自溶，發(fā)酵液發(fā)粘或渾濁，產(chǎn)生大量泡沫，代謝產(chǎn)物的積累迅速減少或停止或下降，有的發(fā)酵液發(fā)臭。發(fā)酵中期染菌，由于營養(yǎng)成分大量消耗，一般挽救處理困難，危害性很大常用的方法有：降低罐溫，控制殘?zhí)橇?，降低空氣流量或冷置待放?4、發(fā)酵后期染菌 發(fā)酵后期產(chǎn)物積累較多，糖等營養(yǎng)物質(zhì)接近耗盡，如果染菌不太多，可繼續(xù)進(jìn)行發(fā)酵；如污染嚴(yán)重，破壞性較大，可以采取提前放罐。,.,二、不同染菌規(guī)模的原因分析 1、當(dāng)發(fā)酵出現(xiàn)連續(xù)染菌或大面積染菌，一般是公用系統(tǒng)有問題，特別是空氣系統(tǒng)?？偪者^濾器失效，過濾效率下降，新裝過濾器要裝好，避免空氣走短路。 接種和中間補糖設(shè)備系統(tǒng)有滲漏和死角，也會造成大面積染菌因此要按時檢查維修相關(guān)設(shè)備。 2、部分發(fā)酵罐染菌，發(fā)生在前期可能是滅菌不徹底或種子罐帶菌所致，同時也與公用接種設(shè)備系統(tǒng)有關(guān)；染菌發(fā)生在中后期，一般與補料有關(guān)。 3、個別罐連續(xù)染菌時要檢查該罐設(shè)備的各個部件，查找有無滲漏和死角，如降溫盤管穿孔是造成染菌的多見原因之一。個別罐批偶爾染菌，原因比較復(fù)雜，要針對具體情況，視染菌時間和染菌類型，從操作到設(shè)備作具體分析。,.,三、從染菌類別上分析原因 1、染革蘭氏陽性桿菌、酵母菌等其它雜菌多是由空氣系統(tǒng)中帶入而造成污染也有可能是種子帶菌 2、染革蘭氏陰性桿菌、特別是球菌大多數(shù)因設(shè)備滲漏所致，帶菌的冷卻水或污水，從冷卻盤管、連接法蘭、襯里焊縫中滲漏進(jìn)入發(fā)酵罐培養(yǎng)基中。 3、染耐熱的芽孢桿菌，可能是培養(yǎng)基或設(shè)備滅菌不徹底但并不是絕對的，空氣帶菌也常引起染芽孢桿菌； 4、染霉菌，一般是無菌室滅菌不徹底或操作問題 四、染菌的途徑和防治 （一）種子帶菌及其防治 種子帶菌的原因： 1、培養(yǎng)基及用具滅菌不徹底 菌種培養(yǎng)基及用具滅菌均在滅菌鍋中進(jìn)行，造成滅菌不徹底主要是滅菌時鍋內(nèi)空氣排放不完全，造成假壓，使滅菌時溫度還達(dá)不到要求。 2、菌種在移種過程中受污染 菌種的移接工作是在無菌室中，按無菌操作進(jìn)行的。當(dāng)菌種移接操作不當(dāng)或管理不嚴(yán)，就可能引起污染。,.,3、菌種在培養(yǎng)過程或保藏過程中受污染 菌種在培養(yǎng)過程和保藏過程中，由于外界空氣進(jìn)入，也使雜菌進(jìn)入而受污染。為了防止污染，試管的棉花塞應(yīng)有一定的緊密度，不宜太松，且有一定的長度，培養(yǎng)和保藏溫度不宜變化太大。在放入搖床后要經(jīng)常去檢查種母搖瓶的狀況。 （二）無菌空氣帶菌及防止 空氣凈化系統(tǒng)失效或空氣精過、預(yù)過減效是發(fā)酵染菌的主要原因之一。具體防止措施：定期更新主空氣系統(tǒng)的過濾介質(zhì)，加強平時系統(tǒng)的排污除水，特別是在多雨或潮濕的天氣。確保進(jìn)入車間之前的空氣升溫至45--55℃，使相對 濕度下降，定時拆檢空氣精過、預(yù)過。（做空氣系統(tǒng)無菌檢查） （三）培養(yǎng)基和設(shè)備滅菌不徹底帶菌及防止 培養(yǎng)基和設(shè)備滅菌不徹底的原因，主要與以下幾個方面有關(guān) 1、原料形狀 一般稀薄的培養(yǎng)基容易滅菌徹底，而含有固體顆粒或粘稠狀物料時容易由于滅菌不徹底而造成染菌。這就要求在投料時確保攪拌混合均勻。 2、實消時未充分排除罐內(nèi)空氣 實消時罐內(nèi)空氣未完全排除造成假壓，使罐頂空間局部溫度達(dá)不到滅菌要求，導(dǎo)致滅菌不徹底而污染。因此在實消升溫時，應(yīng)打開排氣閥門及有關(guān)連接管的邊閥、罐頂部的接管邊閥，使蒸汽通過達(dá)到徹底滅菌。,.,3、設(shè)備管道存在死角染菌及防止 由于操作、設(shè)備結(jié)構(gòu)、安裝或人為造成的等原因，引起蒸汽不能到達(dá)預(yù)定部位，這就是死角。所以發(fā)酵罐要合理簡化安裝管、閥。凡不合理的管、閥、開孔都要堅決去掉，遺留的孔眼要焊平，消除隱患。管道之間盡可能用焊接來代替法蘭，不能用直角彎頭，要保持管道暢通、光滑、密封。主要閥門及其墊應(yīng)經(jīng)常檢查更換。 4、設(shè)備滲漏引起染菌及防止 發(fā)酵設(shè)備、管道、閥門的長期使用，由于腐蝕、摩擦、振動或憋壓等原因，往往會造成滲漏。例如：設(shè)備的表面或焊縫處有砂眼，由于腐蝕逐漸加深，最終導(dǎo)致穿孔；冷卻管受攪拌器作用，長期磨損，焊縫處受冷熱和振動產(chǎn)生裂縫而滲漏。防止措施：要選用優(yōu)質(zhì)材料并經(jīng)常檢查，小滲漏不易發(fā)現(xiàn)時可壓入堿性水，在可疑的地方用浸濕的酚酞指示劑的白布擦，如有滲漏時白布顯紅色。 5、操作問題 在發(fā)酵過程中如操作不當(dāng)也引起染菌，如移種時或發(fā)酵培養(yǎng)時罐內(nèi)壓力跌零，使外界空氣進(jìn)入而染菌；泡沫冒頂而造成染菌；壓縮空氣壓力突然下降使發(fā)酵液倒流入空氣過濾器而造成染菌等等；防止措施：加強對一線操作人員的無菌操作培訓(xùn)和始終貫徹?zé)o菌操作制度及責(zé)任心教育，加強管理措施。,.,6、環(huán)境衛(wèi)生 發(fā)酵車間和菌種室的內(nèi)外環(huán)境，必須保持干凈整潔，定期清掃和消毒，車間周圍不得堆放廢棄物，不允許有活菌排放；有異味或易飛揚的物料的貯存，應(yīng)遠(yuǎn)離發(fā)酵車間和菌種室。 五、染菌的檢查 （一）感官檢查 1、大部分染菌的發(fā)酵液可以從發(fā)酵的異常情況來檢出，如色澤、異味、變稠或變稀、加堿速率、菌絲變形產(chǎn)酸不正常或不產(chǎn)酸或倒酸而糖卻消耗很快。 2、借助顯微鏡，常用梅蘭染色、結(jié)晶紫染色和革蘭氏染色來判斷。 （二）、無菌平皿劃線檢查 平板檢查法既可檢查出雜菌污染，又可以檢查出有無噬菌體污染。檢查雜菌時，先將滅菌后的培養(yǎng)基倒入已經(jīng)滅,.,（四）、環(huán)境衛(wèi)生 發(fā)酵車間和菌種室的內(nèi)外環(huán)境，必須保持干凈整潔，定期清掃和消毒，車間周圍不得堆放廢棄物，不允許有活菌排放，有異味或易飛揚的物料的貯存，應(yīng)遠(yuǎn)離發(fā)酵車間和菌種室。 七、染菌的檢查 1、培養(yǎng)液的生化指標(biāo)變化情況。 大部分染菌的發(fā)酵液可以從發(fā)酵的異常情況來檢出，如色澤、異味、粘度、PH、DO、菌絲形狀、產(chǎn)酸、耗糖、產(chǎn)物等。 2、鏡檢：常用美蘭染色、結(jié)晶紫染色和革蘭氏染色來判斷。 3、無菌試驗 平板檢查法：既可檢查出雜菌污染，又可以檢查出有無噬菌體污染。檢查雜菌時，先將滅菌后的培養(yǎng)基倒入已經(jīng)滅菌的培養(yǎng)皿內(nèi)，冷卻后置于37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24小時，進(jìn)行鏡檢?；蛘邔⒋龣z樣品置于37℃培養(yǎng)6小時，使細(xì)菌生長，增加數(shù)量，然后再劃線接種培養(yǎng)。這樣可以提高平板法的靈敏度 肉湯培養(yǎng)檢查法：主要用于空氣系統(tǒng)和培養(yǎng)基染菌的檢查。具體的做法是將培養(yǎng)液裝在吸所瓶中，滅菌30分鐘后，置于37℃培養(yǎng)24小時，如無混濁即可用于上述兩項的檢查。將無菌空氣或滅菌后的培養(yǎng)基引入后保溫培養(yǎng)，觀察有無混濁現(xiàn)象發(fā)生，如呈現(xiàn)渾濁說明染菌,