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生物技術(shù)制藥BiotechnologicalPharmaceutics,一、課程內(nèi)容,第一章緒論第二章基因工程制藥第三章動(dòng)物細(xì)胞工程制藥第四章抗體制藥第五章植物細(xì)胞工程制藥第六章酶工程制藥第七章發(fā)酵工程制藥,Chapter1緒論,第一節(jié)生物技術(shù)的發(fā)展史,,一、生物技術(shù)（biotechnology）,生物技術(shù)：以生命科學(xué)為基礎(chǔ)，利用生物體（或生物組織、細(xì)胞及其組分）的特性和功能，設(shè)計(jì)構(gòu)建具有預(yù)期性狀的新物種或新品系，并與工程相結(jié)合，利用這樣的新物種（或品系）進(jìn)行加工生產(chǎn)，為社會(huì)提供商品和服務(wù)的一個(gè)綜合性的技術(shù)體系。包括基因工程、細(xì)胞工程、發(fā)酵工程、酶工程、生化工程以及后來(lái)衍生出來(lái)的第二代、第三代的蛋白質(zhì)工程、抗體工程、糖鏈工程和海洋生物技術(shù)等。,⑴不可取代性（育種、制藥）⑵快速、精確（單克隆抗體檢測(cè)妊娠）⑶低耗、高效（生物酶催化：化學(xué)催化）⑷副產(chǎn)物少、副作用小、安全性好⑸高附加值性⑹符合生態(tài)型的經(jīng)濟(jì)技術(shù)發(fā)展體系,生物技術(shù)的優(yōu)越性,現(xiàn)代生物技術(shù)的基礎(chǔ)學(xué)科和分支,,,,,,,,分子生物學(xué)微生物學(xué)生物化學(xué)遺傳學(xué)細(xì)胞生物學(xué)化學(xué)工程,現(xiàn)代生物技術(shù),醫(yī)藥生物技術(shù),生物技術(shù)疫苗,生物技術(shù)診斷,農(nóng)業(yè)生物技術(shù),家畜生物技術(shù),海洋生物技術(shù),二、生物技術(shù)發(fā)展簡(jiǎn)史,傳統(tǒng)生物技術(shù)的技術(shù)特征是釀造技術(shù)公元前6000年古代巴比倫人釀造啤酒公元前4000年埃及人發(fā)酵面包我國(guó)殷朝制醬周朝制醋特點(diǎn):自然發(fā)酵、全憑經(jīng)驗(yàn),,１傳統(tǒng)生物技術(shù)階段,近代生物技術(shù)的技術(shù)特征是微生物發(fā)酵技術(shù)1674年荷蘭布商列文虎克自制了高倍顯微鏡(300倍左右)觀察到了微生物。1865年法國(guó)科學(xué)家巴斯德證明了發(fā)酵原理。1928年英國(guó)Fleming發(fā)現(xiàn)青霉素1940年英國(guó)弗洛里、錢恩分離出青霉素,２近代生物技術(shù)階段,近代生物技術(shù)時(shí)期的特點(diǎn)：,1.產(chǎn)品類型多初級(jí)（氨基酸、酶、有機(jī)酸）；次級(jí)（抗生素）；生物轉(zhuǎn)化（甾體）等；2.生物技術(shù)要求高（純種、無(wú)菌、通氣、產(chǎn)品質(zhì)量要求也高）；3.生產(chǎn)設(shè)備規(guī)模巨大500立方米，2000立方米；4.技術(shù)發(fā)展速度快。青霉素初期發(fā)酵效價(jià)為200U/ml,現(xiàn)在為80000U/ml。,現(xiàn)代生物技術(shù)的技術(shù)特征就是以基因工程為首要標(biāo)志1953年Watson、Crick提出DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)1973年建立DNA重組技術(shù)（Boyer促紅細(xì)胞生成素（EPO）以全球銷售額38億美元的業(yè)績(jī)，居全球最暢銷10種藥物的第6名；美國(guó)是現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)源地，一直穩(wěn)居生物技術(shù)藥物研發(fā)榜首,其2002年產(chǎn)值和銷售額已超過(guò)200億美元;1989年我國(guó)第一個(gè)擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的基因工程藥物--重組人干擾素（IFN–α1b）上市以來(lái)，目前，世界上銷售額排前10位的生物技術(shù)藥物我國(guó)已能生產(chǎn)8種。,國(guó)際生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展動(dòng)態(tài),第一節(jié)概述,生物技術(shù)的核心就是基因工程，20世紀(jì)70年代基因工程誕生,最先應(yīng)用在醫(yī)藥科學(xué)領(lǐng)域。傳統(tǒng)生物藥物由于來(lái)源及制備上的困難、價(jià)格等因素的影響，此外在制備過(guò)程可能受到的病毒、衣原體、支原體等的感染等問(wèn)題，促使人們尋求安全、實(shí)用、療效可靠的新方法來(lái)制備生物藥物。（如：生長(zhǎng)激素抑制素1mg傳統(tǒng)法：10萬(wàn)只羊的下丘腦，現(xiàn)：10L大腸桿菌培養(yǎng)液，0.3美元/mg；尿激酶從男性尿中提??；胎盤丙種球蛋白從胎盤中提取。,,應(yīng)用基因工程技術(shù)可十分方便且有效地解決傳統(tǒng)生物制藥所遇到的問(wèn)題，從量、質(zhì)上都可以得到改進(jìn)，且可以創(chuàng)造全新物質(zhì)。如今，癌癥、病毒性疾病、心血管疾病以及內(nèi)分泌等方面的預(yù)防、治療和診斷已可通過(guò)基因工程技術(shù)獲得。,利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)藥品的優(yōu)點(diǎn)：,（1）可以大量生產(chǎn)過(guò)去難以獲得的生理活性蛋白和多肽（如胰島素、干擾素、細(xì)胞因子等），為臨床使用提供有效的保障；（2）可以提供足夠數(shù)量的生理活性物質(zhì)，以便對(duì)其生理、生化和結(jié)構(gòu)進(jìn)行深入的研究，從而擴(kuò)大這些物質(zhì)的應(yīng)用范圍；（3）利用基因工程技術(shù)可以發(fā)現(xiàn)、挖掘更多的內(nèi)源性生理活性物質(zhì)；,（4）內(nèi)源性生理活性物質(zhì)在作為藥物使用時(shí)存在的不足之處，可通過(guò)基因工程和蛋白質(zhì)工程進(jìn)行改造和去除。如白細(xì)胞介素-2的半胱氨酸改為絲氨酸或丙氨酸，白細(xì)胞介素-2的活性以及熱穩(wěn)定性均有提高；（5）利用基因工程技術(shù)可獲得新型化合物，擴(kuò)大藥物篩選來(lái)源。,利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)藥品的優(yōu)點(diǎn)：,第二節(jié)基因工程藥物生產(chǎn)的過(guò)程,基因工程技術(shù)是將所要重組對(duì)象的目的基因插入載體、拼接、轉(zhuǎn)入新的宿主細(xì)胞，構(gòu)建成工程菌(或細(xì)胞），實(shí)現(xiàn)遺傳物質(zhì)的重新組合，并使目的基因在工程菌(或細(xì)胞），內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)的技術(shù)。,,基因工程藥物生產(chǎn)的上游和下游,上游階段：主要指的是目的基因分離、工程菌（或細(xì)胞）構(gòu)建。上游階段的工作主要在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)完成；下游階段：主要指的是從工程菌（或細(xì)胞）的大規(guī)模培養(yǎng)一直到產(chǎn)品的分離純化、質(zhì)量控制等。,獲得目的基因,組建重組質(zhì)粒,培養(yǎng)工程菌,構(gòu)建基因工程菌或細(xì)胞,產(chǎn)物分離純化,除菌過(guò)濾,半成品檢定,包裝,成品檢定,,,,,,,,,,基因工程藥物制備的一般過(guò)程,基因工程基本過(guò)程,切,接,轉(zhuǎn),增檢,工程菌（或細(xì)胞）構(gòu)建中重要的工具,工具：酶限制性內(nèi)切酶連接酶逆轉(zhuǎn)錄酶Klenow酶大片段（DNA聚合酶I）核酸酶S1,第三節(jié)目的基因的獲得,克隆真核基因常用方法：逆轉(zhuǎn)錄法和化學(xué)合成法。（不能直接分離？）一、逆轉(zhuǎn)錄法逆轉(zhuǎn)錄法就是先分離純化目的基因的mRNA，再反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后進(jìn)行cDNA的克隆表達(dá)。cDNA與模板mRNA序列嚴(yán)格互補(bǔ)，而不含內(nèi)含子。,,逆轉(zhuǎn)錄法的步驟1、mRNA的純化2、cDNA第一鏈的合成3、cDNA第二鏈的合成4、cDNA克隆5、將重組體導(dǎo)入宿主細(xì)胞6、cDNA文庫(kù)的鑒定7、目的cDNA克隆的分離和鑒定,cDNA克隆示意圖,mRNA,,,,逆轉(zhuǎn)錄酶,ss-DNA,,,,,ds-cDNA,,,,ds-cDNA,核酸酶S1,1、mRNA的純化,真核細(xì)胞mRNA3’-polyA（20～250)采用OligodT-纖維素，以親和層析法將mRNA從細(xì)胞總RNA中分離出來(lái)。,2、cDNA第一鏈的合成,可用寡聚dT作為引物，在逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下，開始cDNA鏈的合成。,3、cDNA第二鏈的合成,除去cDNA-mRNA雜交鏈中的mRNA鏈(堿解或RNaseH酶解)然后以cDNA第一鏈為模板合成第二鏈。由于第一鏈cDNA鏈3’-末端往往形成一個(gè)發(fā)夾形結(jié)構(gòu)，所以，可以從這一點(diǎn)開始合成cDNA第二鏈(常用Klenow酶或DNA聚合酶I)切除發(fā)夾結(jié)構(gòu)（核酸酶S1，專一性切除單鏈DNA）,4、cDNA克隆,用于cDNA克隆的載體有三類：細(xì)菌質(zhì)粒（如pBR322、pUC等）插入片段10kb動(dòng)植物病毒根據(jù)重組后插入的cDNA能否經(jīng)轉(zhuǎn)錄和翻譯合成蛋白質(zhì)非表達(dá)型載體（pBR322及?gt10）表達(dá)型載體（pUC及?gt11）有利于目的基因的篩選,5、將重組體導(dǎo)入宿主細(xì)胞,1、轉(zhuǎn)化：指質(zhì)粒DNA或以它為載體構(gòu)建的重組DNA導(dǎo)入細(xì)菌的過(guò)程。2、轉(zhuǎn)染：指病毒或以它為載體構(gòu)建的重組子導(dǎo)入真核細(xì)胞的過(guò)程。脂質(zhì)體介導(dǎo)：原生質(zhì)體融合：電穿孔：顯微注射：基因槍：病毒介導(dǎo)：農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)染：,6、cDNA文庫(kù)的鑒定,1、表型改變：抗生素抗性（抗性基因失活和菌落或噬菌斑顏色改變）a互補(bǔ)：報(bào)告基因：缺陷恢復(fù)：2、結(jié)構(gòu)特征：DNA大小：酶切圖譜：雜交（核酸、蛋白）：PCR檢測(cè)：DNA序列分析3、免疫化學(xué)檢測(cè)：表達(dá)產(chǎn)物分析,7、目的cDNA克隆的分離和鑒定,從cDNA文庫(kù)中分離特異的cDNA克隆，主要采用：（1）核酸探針雜交法。根據(jù)目的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，人工合成相應(yīng)的單鏈寡核苷酸作為探針，從cDNA文庫(kù)中分離特異cDNA克隆。（2）免疫反應(yīng)鑒定法。用表達(dá)型載體構(gòu)建的cDNA文庫(kù)，可用免疫學(xué)方法分組逐一鑒定各cDNA的表達(dá)產(chǎn)物，即以某種蛋白質(zhì)的抗體尋找相應(yīng)的特異cDNA克隆。,分離得到含有目的基因的陽(yáng)性克隆后，必須對(duì)其作進(jìn)一步的驗(yàn)證和鑒定（限制酶圖譜、基因測(cè)序等）。,不需合成第二鏈,mRNA,,逆轉(zhuǎn)錄酶,ss-DNA,PCR,特異引物,,目的cDNA鏈,1985，PCR發(fā)明以后，RT-PCR得到了廣泛的應(yīng)用。,二、逆轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應(yīng)法（RT-PCR）,三、化學(xué)合成法較小的蛋白質(zhì)或多肽的編碼基因可以用化學(xué)合成法合成。必須知道目的基因的核苷酸順序或目的蛋白質(zhì)的氨基酸順序。人工化學(xué)合成的限制：一不能合成太長(zhǎng)的基因，50～60bp；二是人工合成時(shí)，遺傳密碼的簡(jiǎn)并性可導(dǎo)致中性突變；三是費(fèi)用較高。,第四節(jié)基因表達(dá),,基因表達(dá)：是指結(jié)構(gòu)基因在生物體中的轉(zhuǎn)錄、翻譯以及所有加工過(guò)程?；蚋咝П磉_(dá)：將外源基因片段拼接到另一個(gè)基因表達(dá)體系中，使即獲得原生物活性又可高產(chǎn)的表達(dá)產(chǎn)物。最佳的基因表達(dá)體系：生物活性高、表達(dá)產(chǎn)量高、表達(dá)產(chǎn)物穩(wěn)定、表達(dá)產(chǎn)物容易分離純化。,一、宿主細(xì)胞的選擇,1、培養(yǎng)容易、生長(zhǎng)快速：2、容易獲得較高濃度的細(xì)胞：3、能利用易得廉價(jià)原料：4、不致病、不產(chǎn)生內(nèi)毒素：5、發(fā)熱量低、需氧低、適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵溫度：6、容易進(jìn)行DNA重組技術(shù)操作：7、產(chǎn)物的產(chǎn)量、產(chǎn)率高：8、產(chǎn)物容易提取純化：,,宿主細(xì)胞常用兩大類：原核細(xì)胞：常用有大腸桿菌、枯草芽胞桿菌、鏈霉菌等；真核細(xì)胞：常用有酵母、絲狀真菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞等。,原核細(xì)胞,⑴大腸桿菌：基因工程研究中采用最多的原核表達(dá)體系。優(yōu)點(diǎn)：生長(zhǎng)快速、代謝簡(jiǎn)單、遺傳體系清楚、容易操作、細(xì)胞破碎容易。缺點(diǎn)：①不存在導(dǎo)向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的信號(hào)序列，分泌能力不足，產(chǎn)品多為胞內(nèi)產(chǎn)物，提取困難；②蛋白表達(dá)后不能修飾加工（糖基化等）；③產(chǎn)物蛋白質(zhì)N端多余一個(gè)蛋氨酸殘基，能引起免疫反應(yīng)；④內(nèi)毒素存留。,⑵枯草芽胞桿菌：分泌能力強(qiáng)，蛋白質(zhì)不形成包含體。產(chǎn)物蛋白質(zhì)不能糖基化。有很強(qiáng)的胞外蛋白酶對(duì)產(chǎn)物降解。⑶鏈霉菌：作為外源性基因表達(dá)受到重視。不致病、使用安全、分泌能力強(qiáng)、表達(dá)產(chǎn)物可糖基化。,真核細(xì)胞,⑴酵母是研究基因表達(dá)最有效的單細(xì)胞真核微生物。其基因組小，世代時(shí)間短，有單倍體雙倍體兩種形式，繁殖迅速，無(wú)毒性。能外分泌，產(chǎn)物可糖基化。已有不少真核基因成功表達(dá)。,⑵絲狀真菌優(yōu)點(diǎn)：分泌能力強(qiáng)，能正確進(jìn)行翻譯后加工（肽剪切、糖基化）有成熟的發(fā)酵和后處理工藝。⑶哺乳動(dòng)物細(xì)胞優(yōu)點(diǎn)：表達(dá)產(chǎn)物可由重組轉(zhuǎn)化細(xì)胞分泌到培養(yǎng)液中，純化容易。產(chǎn)物是糖基化的接近天然物。缺點(diǎn)：生長(zhǎng)慢，生產(chǎn)率低，培養(yǎng)條件苛刻，費(fèi)用高，培養(yǎng)液濃度稀。,二、大腸桿菌體系中的基因表達(dá),,（一）表達(dá)載體表達(dá)載體必須具備的條件（1）載體能獨(dú)立地進(jìn)行復(fù)制(復(fù)制起點(diǎn)，ori)（2）應(yīng)具有靈活的克隆位點(diǎn)和方便的篩選標(biāo)記，以利于外源基因的克隆、鑒定和篩選，且克隆位點(diǎn)位于啟動(dòng)子序列后，以便外源基因表達(dá)。（3）應(yīng)具有很強(qiáng)的啟動(dòng)子，能為大腸桿菌的RNA聚合酶所識(shí)別。,（4）應(yīng)具有阻遏子，使啟動(dòng)子受到控制，只有當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)才進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。外源基因的高效表達(dá)往往會(huì)抑制宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖，而阻遏子可使宿主細(xì)胞免除此不良影響（5）應(yīng)具有很強(qiáng)的終止子，以便使RNA聚合酶集中力量轉(zhuǎn)錄克隆的外源基因，而不轉(zhuǎn)錄其他無(wú)關(guān)的基因，同時(shí)，很強(qiáng)的終止子所產(chǎn)生的mRNA較為穩(wěn)定。（6）所產(chǎn)生的mRNA必須具有翻譯的起始信號(hào)，即起始密碼AUG和SD序列,以便轉(zhuǎn)錄后能順利翻譯。如：在大腸桿菌中表達(dá)非融合蛋白的操縱子必須改建成：細(xì)菌啟動(dòng)子—細(xì)菌SD序列—起始密碼子—結(jié)構(gòu)基因—終止子。,常用表達(dá)載體pBV220系統(tǒng),啟動(dòng)子,多克隆位點(diǎn),終止子,阻遏子,P23,復(fù)制起始位點(diǎn),它已成功地表達(dá)了人白細(xì)胞介素2，γ干擾素和腫瘤壞死因子等外源基因。,氨芐青霉素抗性基因,限制性內(nèi)切酶,SD序列,pBV220系統(tǒng)國(guó)內(nèi)使用最多的載體,其組成:①來(lái)源于pUC8多克隆位點(diǎn)②核糖體rrnB基因終止信號(hào)③pBR322第4225～3735位④pUC18第2066～680位⑤λ噬菌體cIts857阻遏子基因及PR啟動(dòng)子⑥pRC23的PL啟動(dòng)子及SD序列,pBV220系統(tǒng)優(yōu)點(diǎn)：①cIts857阻遏子基因與PL啟動(dòng)子同在一個(gè)載體上，可以轉(zhuǎn)化任何菌株，以便選用蛋白酶活性較低的宿主細(xì)胞，使表達(dá)產(chǎn)物不易降解。②SD序列緊跟多克隆位點(diǎn)，便于插入帶起始ATG的外源基因，可表達(dá)非融合蛋白；③強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)可防止出現(xiàn)“通讀”現(xiàn)象，有利于質(zhì)粒-宿主系統(tǒng)的穩(wěn)定；,④整個(gè)質(zhì)粒僅為3.66kb，有利于增加其拷貝數(shù)及容量，可以插入大片段外源基因；⑤PR和PL啟動(dòng)子串聯(lián)，可以增強(qiáng)啟動(dòng)作用；本系統(tǒng)為溫度誘導(dǎo)，外源基因表達(dá)量可達(dá)細(xì)胞總蛋白的20%～30%；產(chǎn)物以包含體形式存在不易降解均一性好。,PR和PL啟動(dòng)子,選用溫度敏感突變體cIts857的基因產(chǎn)物來(lái)調(diào)控PL、PR啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。在較低溫度（30℃）時(shí)以活性形式存在在較高溫度（42℃）時(shí)失活脫落,PL、PR,cIts857,PL和PR表達(dá)系統(tǒng)存在的問(wèn)題PL和PR表達(dá)系統(tǒng)誘導(dǎo)時(shí)不加化學(xué)誘導(dǎo)劑，成本又低廉。缺陷1.在熱脈沖誘導(dǎo)過(guò)程中，大腸桿菌熱休克蛋白的表達(dá)也會(huì)被激活，其中一些是蛋白水解酶，有可能降解所表達(dá)的重組蛋白。2.在大體積發(fā)酵培養(yǎng)菌體時(shí)，通過(guò)熱平衡交換方式把培養(yǎng)溫度從30℃提高到42℃需要較長(zhǎng)的時(shí)間，這種緩慢的升溫方式影響誘導(dǎo)效果，對(duì)重組蛋白表達(dá)量有一定的影響。,3.pBV220系統(tǒng)表達(dá)的外源蛋白以包含體的形式存在，不易純化。,pBG-2是由pBV220系統(tǒng)衍生的便于產(chǎn)物純化的融合表達(dá)載體。該質(zhì)粒在PRPL啟動(dòng)子下游插入G蛋白中與IgGFc段結(jié)合的結(jié)構(gòu)域基因片段180個(gè)核苷酸，下游是多克隆位點(diǎn)，引入了剪切融合蛋白的切點(diǎn)，具有與IgG結(jié)合的活性，可用親和層析。簡(jiǎn)化下游工藝。,pBG-2,（二）影響目的基因在大腸桿菌中表達(dá)的因素,外源基因表達(dá)產(chǎn)量與細(xì)胞濃度和單個(gè)細(xì)胞平均表達(dá)產(chǎn)量呈正相關(guān)。單個(gè)細(xì)胞產(chǎn)量取決于：⑴外源基因的拷貝數(shù)質(zhì)粒的擴(kuò)增過(guò)程通常發(fā)生在受體細(xì)胞的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)，而此時(shí)正是細(xì)菌生理代謝最旺盛的階段。質(zhì)粒分子的過(guò)度增殖以及其后目的基因的高效表達(dá)勢(shì)必會(huì)影響受體細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝，進(jìn)而導(dǎo)致重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性以及目的基因宏觀表達(dá)水平的下降解決上述難題的一種有效策略是將重組質(zhì)粒的擴(kuò)增納入可控制的軌道,⑵外源基因的表達(dá)效率外源基因在大腸桿菌中高效表達(dá)的原理啟動(dòng)子終止子核糖體結(jié)合位點(diǎn)密碼子,,,轉(zhuǎn)錄,翻譯,①啟動(dòng)子和終止子的強(qiáng)弱；大腸桿菌高效表達(dá)需要強(qiáng)的啟動(dòng)子和終止子。外源基因在強(qiáng)啟動(dòng)子的控制下表達(dá)，容易發(fā)生轉(zhuǎn)錄過(guò)頭現(xiàn)象，即RNA聚合酶滑過(guò)終止子結(jié)構(gòu)繼續(xù)轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒上鄰近的DNA序列，形成長(zhǎng)短不一的mRNA混合物過(guò)長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄物的產(chǎn)生在很大程度上會(huì)影響外源基因的表達(dá)。對(duì)于一些終止作用較弱的終止子，通?？梢圆捎枚垠w終止子串聯(lián)的特殊結(jié)構(gòu)，以增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄終止作用。,外源基因在大腸桿菌細(xì)胞中的高效表達(dá)不僅取決于轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)的頻率，而且在很大程度上還與mRNA的翻譯起始效率密切相關(guān)。mRNA翻譯的起始效率主要由其5‘端的結(jié)構(gòu)序列（消除二級(jí)結(jié)構(gòu)）所決定，稱為核糖體結(jié)合位點(diǎn)（RBS）。,②核糖體結(jié)合位點(diǎn)的有效性,③SD序列與翻譯起始密碼子之間的距離SD序列與起始密碼子AUG之間的精確距離保證了mRNA在核糖體上定位后，翻譯起始密碼子AUG正好處于核糖體復(fù)合物結(jié)構(gòu)中的P位，這是翻譯啟動(dòng)的前提條件。在很多情況下，SD序列位于AUG之前大約七個(gè)堿基處，在此間隔中少一個(gè)堿基或多一個(gè)堿基，均會(huì)導(dǎo)致翻譯起始效率不同程度的降低。,由于原核生物和真核生物基因組中密碼子的使用頻率具有較大程大的差異性，因此外源基因尤其是高等哺乳動(dòng)物基因在大腸桿菌中高效翻譯的一個(gè)重要因素是密碼子的正確選擇。一般而言，有兩種策略可以使外源基因上的密碼子在大腸桿菌細(xì)胞中獲得最佳表達(dá)：外源基因全合成同步表達(dá)相關(guān)tRNA編碼基因,④密碼子組成,生物體對(duì)密碼子的偏愛(ài)性,⑶表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性①組建融合蛋白；②利用大腸桿菌的信號(hào)肽或真核多肽中自身的信號(hào)肽；③采用位點(diǎn)突變的方法；④選用蛋白酶缺陷型大腸桿菌為宿主細(xì)胞，可能會(huì)減弱表達(dá)產(chǎn)物的降解。,⑷細(xì)胞代謝負(fù)荷①宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)與重組質(zhì)粒的復(fù)制分開②細(xì)胞的生長(zhǎng)和外源基因的表達(dá)分成兩個(gè)階段⑸工程菌的培養(yǎng)條件除宿主、載體和克隆基因三者之間的關(guān)系影響外源基因的高水平表達(dá)外，培養(yǎng)條件亦是非常值得研究的因素。以后會(huì)對(duì)其進(jìn)行詳細(xì)的介紹。,（三）真核基因在大腸桿菌中的表達(dá)形式,⑴以融合蛋白的形式表達(dá)藥物基因以原核多肽和真核蛋白結(jié)合在一起稱融合蛋白。優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便，表達(dá)蛋白在菌體內(nèi)穩(wěn)定，易實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)；缺點(diǎn)：只能作抗原用。,⑵以非融合蛋白的形式表達(dá)藥物基因非融合蛋白指在大腸桿菌中表達(dá)的蛋白質(zhì)以真核蛋白的mRNA的AUG為起始，在其氨基端不含細(xì)菌多肽序列。優(yōu)點(diǎn)：保持原有蛋白活性；缺點(diǎn)：易被蛋白酶破壞。,⑶分泌型表達(dá)蛋白藥物基因優(yōu)點(diǎn)：在周質(zhì)中穩(wěn)定，有活性，不含蛋氨酸殘基；缺點(diǎn)：產(chǎn)量不高，信號(hào)肽不被切割。,三、酵母中的基因表達(dá),（一）表達(dá)載體酵母載體是可以攜帶外源基因在酵母細(xì)胞內(nèi)保存和復(fù)制，并隨酵母分裂傳遞到子代細(xì)胞的DNA或RNA單位。1.載體的復(fù)制序列①酵母附加體質(zhì)粒（yeastepisomalplasmid，Yep類）②酵母復(fù)制型質(zhì)粒（yeastreplicationplasmid，Ypp類）③酵母著絲粒質(zhì)粒（yeastcentromericplasmid，YCp類）④酵母整合型質(zhì)粒（yeastinteegrativeplasmid，YIp類）,(1)克隆載體從大腸桿菌中制備質(zhì)粒比從酵母中容易得多，因此酵母質(zhì)粒的加工和制備大部分是通過(guò)大腸桿菌進(jìn)行的，只有在最后階段才轉(zhuǎn)入酵母中，這就要求酵母載體也同時(shí)具有在大腸桿菌中復(fù)制和增殖的能力。(2)表達(dá)載體將酵母菌的啟動(dòng)子和終止子等有關(guān)控制序列引入載體的適當(dāng)位點(diǎn)后，就構(gòu)成了酵母菌的表達(dá)載體。,①普通表達(dá)載體，只能方便地引入外源基因并進(jìn)行表達(dá)，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的組成，特別是對(duì)其N末端氨基酸是否增減并無(wú)嚴(yán)格要求。②精確表達(dá)載體，要求在啟動(dòng)子或信號(hào)肽編碼序列的適當(dāng)部位有內(nèi)切酶點(diǎn)，以利于接入外源基因，并使他在表達(dá)后加工后N末端氨基酸序列與天然產(chǎn)物相同，既無(wú)多余的氨基酸，也無(wú)缺失的氨基酸。,⒉影響目的基因在酵母菌中表達(dá)的因素,⑴外源基因的劑量高穩(wěn)定的高拷貝數(shù)的質(zhì)?？墒雇庠椿蚋咝П磉_(dá)，但高拷貝數(shù)通常會(huì)引起細(xì)胞生長(zhǎng)量的降低；而單拷貝數(shù)的質(zhì)粒對(duì)細(xì)胞的最大生長(zhǎng)沒(méi)有影響，因而也能達(dá)到高效表達(dá)。⑵外源基因的表達(dá)效率①啟動(dòng)子(組成型和誘導(dǎo)型)②分泌信號(hào)的效率③終止序列的影響,外源基因表達(dá)產(chǎn)量與細(xì)胞濃度和單個(gè)細(xì)胞平均表達(dá)產(chǎn)量呈正相關(guān)。單個(gè)細(xì)胞產(chǎn)量取決于：,⑶外源蛋白的糖基化外源蛋白經(jīng)釀酒酵母糖基化后，可靠有效地以活性型分泌到培養(yǎng)基中；某些蛋白質(zhì)糖基化后更加穩(wěn)定，便于分離精制。⑷宿主菌株的影響①菌體生長(zhǎng)力強(qiáng)②菌體內(nèi)源蛋白酶要較弱③菌體性能穩(wěn)定常用的幾乎是突變株，避免使用回復(fù)突變率高的不穩(wěn)定體系；最好使用二倍體或多倍體菌株；④分泌能力強(qiáng)(5)培養(yǎng)條件,四、動(dòng)物中的基因表達(dá),優(yōu)點(diǎn)：產(chǎn)物類似于天然產(chǎn)物，容易分離純化缺點(diǎn)：動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)慢，培養(yǎng)條件苛刻，費(fèi)用高培養(yǎng)液濃度較小。,主要基因工程表達(dá)體系比較,,,,第五節(jié)基因工程菌生長(zhǎng)代謝的特點(diǎn),菌體的生長(zhǎng)通常用比生長(zhǎng)速率來(lái)表示。比生長(zhǎng)速率:菌體生長(zhǎng)速率與培養(yǎng)基中菌體濃度之比。工程菌培養(yǎng)可通過(guò)選用不同的碳源、控制補(bǔ)料和稀釋速率等方法來(lái)控制菌體的生長(zhǎng)。控制菌體的生長(zhǎng)對(duì)提高質(zhì)粒的穩(wěn)定性、減少代謝副產(chǎn)物積累、提高外源蛋白產(chǎn)率有重要意義。,,大腸桿菌的蛋白/菌體量的比值是基本恒定的，因而菌體的生長(zhǎng)速度反映了蛋白質(zhì)的合成速度。培養(yǎng)條件的改變，都會(huì)改變菌體的能量代謝和小分子前體的供應(yīng)，影響生物大分子的和成和菌體的生長(zhǎng)。,一、菌體的生長(zhǎng)與能量的關(guān)系,碳源物質(zhì)是組成培養(yǎng)基的主要成分。碳源物質(zhì)為細(xì)胞提供能量，當(dāng)菌體生長(zhǎng)所需能量大于菌體有氧代謝提供的能量時(shí)，菌體會(huì)產(chǎn)生乙酸，導(dǎo)致培養(yǎng)基的pH值下降，從而影響菌體的生長(zhǎng)。適當(dāng)提高pH，可減少乙酸的抑制作用,,分批培養(yǎng)中選擇不同的碳源，連續(xù)培養(yǎng)中控制稀釋速率等都能一定范圍內(nèi)控制菌體的生長(zhǎng)，從而控制乙酸的產(chǎn)生，減少它的抑制作用。加入蛋氨酸和酵母提取物都能減少乙酸的產(chǎn)生。,大腸桿菌中克隆攜帶氧能力的透明顫菌血紅蛋白（VHB蛋白）的基因可提高菌體生長(zhǎng)速率。采用磷酸乙?；溉毕葜曜鳛樗拗骷?xì)胞，阻止乙酰輔酶A乙酸產(chǎn)生，可提高產(chǎn)量。,,二、菌體生長(zhǎng)與前體供應(yīng)的關(guān)系,在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入氨基酸（小分子前體）能使菌體蛋白合成增加，比生長(zhǎng)率提高。基因工程菌質(zhì)粒的表達(dá)需與宿主細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)共同的前體和催化結(jié)構(gòu)，致工程菌生長(zhǎng)速率降低。,,質(zhì)粒存在對(duì)菌體代謝的影響：中等拷貝質(zhì)粒（56拷貝）的工程菌中與前體合成有關(guān)的酶增加，其質(zhì)粒對(duì)工程菌的生長(zhǎng)影響不大。高拷貝質(zhì)粒的工程菌（240拷貝），生長(zhǎng)速率和菌體總蛋白合成均減少。這與工程菌大量前體被利用引起前體不足，從而產(chǎn)生“嚴(yán)緊反應(yīng)”有關(guān)。,嚴(yán)緊反應(yīng)當(dāng)細(xì)菌發(fā)現(xiàn)它們處于很差的生長(zhǎng)環(huán)境，沒(méi)有足夠的氨基酸來(lái)維持蛋白質(zhì)合成時(shí)，它們就會(huì)停止大部分活動(dòng)，這種現(xiàn)象稱為嚴(yán)緊反應(yīng)。嚴(yán)緊反應(yīng)產(chǎn)生兩種非正常的核酸堆積物，即ppGpp和pppGpp，統(tǒng)稱(P)PPGPP。,嚴(yán)緊反應(yīng)機(jī)制,產(chǎn)生鳥苷四磷酸鳥苷五磷酸,,激活核糖體RelA蛋白（嚴(yán)緊因子）,抑制rRNA基因表達(dá),核糖體與mRNA結(jié)合抑制其翻譯,氨基酸饑餓,,,,GTPATP,,,(p)ppGpp的產(chǎn)生機(jī)制,應(yīng)急因子RelA是一種(p)ppGpp合成酶，約與5%的核糖體結(jié)合在一起。當(dāng)核糖體A位被空載tRNA占據(jù)時(shí)，RelA被激活。一個(gè)空載tRNA進(jìn)入A位就生成一個(gè)(p)ppGpp,(p)ppGpp的作用,應(yīng)急應(yīng)答使得rRNA和tRNA的合成量大幅減少（10-20%），一些mRNA的合成也減少（1/3）。蛋白質(zhì)的降解速率增加，許多代謝調(diào)節(jié)作用開始發(fā)生。,基因工程菌的不穩(wěn)定性主要表現(xiàn)在重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性，這種不穩(wěn)定性具有下列兩種表現(xiàn)形式：一、質(zhì)粒的不穩(wěn)定性分裂不穩(wěn)定：指工程菌分裂時(shí)出現(xiàn)一定比例不含質(zhì)粒子代菌的現(xiàn)象。結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定：指外源基因從質(zhì)粒上丟失或堿基重排、缺失所致工程菌性能的改變。,第六節(jié)基因工程菌的不穩(wěn)定性,影響質(zhì)粒分裂不穩(wěn)定的因素：⑴含質(zhì)粒菌產(chǎn)生不含質(zhì)粒子代菌的頻率；⑵這兩種菌比生長(zhǎng)速度率差異的大小。,質(zhì)粒穩(wěn)定性的分析方法,樣品,,,不含抗性標(biāo)記抗生素平板培養(yǎng)基,,10-12h,100個(gè)菌落,含抗性標(biāo)記抗生素平板培養(yǎng)基,,10-12h,統(tǒng)計(jì)生長(zhǎng)菌落數(shù),重復(fù)三次,計(jì)算比值(穩(wěn)定性stability),二、提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法,1.選擇合適的宿主菌受體細(xì)胞中的限制修飾系統(tǒng)對(duì)外源重組DNA分子的降解2.選擇合適的載體低拷貝質(zhì)粒工程菌產(chǎn)生不含質(zhì)粒子代菌頻率高，增加工程菌質(zhì)粒拷貝數(shù)可提高穩(wěn)定性；高拷貝質(zhì)粒工程菌產(chǎn)生不含質(zhì)粒子代菌頻率低，但如果提高質(zhì)粒拷貝數(shù)，可能抑制菌體生長(zhǎng)，對(duì)穩(wěn)定性不利。,3.施加選擇壓力根據(jù)載體上的抗藥性標(biāo)記，向培養(yǎng)系統(tǒng)中添加相應(yīng)的抗生素藥物和食品生產(chǎn)時(shí)禁止使用抗生素加入大量的抗生素會(huì)使生產(chǎn)成本增加添加一些容易被水解失活的抗生素，只能維持一定時(shí)間添加抗生素選擇壓力對(duì)質(zhì)粒結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定無(wú)能為力載體上的營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記，向培養(yǎng)系統(tǒng)中添加相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)組份培養(yǎng)基復(fù)雜，成本較高,4.分階段控制培養(yǎng)因外源基因表達(dá)造成質(zhì)粒不穩(wěn)定時(shí)，可以考慮將發(fā)酵過(guò)程分階段控制。在生長(zhǎng)階段使外源基因處于阻遏狀態(tài)，避免因表達(dá)造成不穩(wěn)定性問(wèn)題的發(fā)生；在獲得需要的菌體密度后，再去阻遏或誘導(dǎo)外源基因表達(dá)。連續(xù)培養(yǎng)時(shí)可以考慮采用多級(jí)培養(yǎng)，如在第一級(jí)進(jìn)行生長(zhǎng)，維持菌體的穩(wěn)定性，在第二級(jí)進(jìn)行表達(dá)。,5.控制培養(yǎng)條件工程菌的培養(yǎng)條件對(duì)其質(zhì)粒的穩(wěn)定性和表達(dá)效率影響很大可調(diào)控的環(huán)境參數(shù)為：培養(yǎng)基組分、培養(yǎng)溫度、pH和溶解氧濃度。有些含質(zhì)粒的菌對(duì)發(fā)酵環(huán)境的改變比不含質(zhì)粒的菌反應(yīng)慢，因而采用間隙改變培養(yǎng)條件的方法以改變這兩種菌的比生長(zhǎng)速率，從而改善質(zhì)粒的穩(wěn)定性。通過(guò)間隙供氧的方法和通過(guò)改變稀釋速率的方法都可提高質(zhì)粒的穩(wěn)定性。培養(yǎng)基組成：限制培養(yǎng)基比豐富培養(yǎng)基更有利于穩(wěn)定培養(yǎng)溫度：較低的培養(yǎng)溫度有利于重組質(zhì)粒的穩(wěn)定,6.固定化固定化可以提高基因重組大腸桿菌的穩(wěn)定性基因重組大腸桿菌進(jìn)行固定化后，質(zhì)粒的穩(wěn)定性及目的產(chǎn)物的表達(dá)率都有了很大提高。在游離重組菌系統(tǒng)中常用抗生素，氨基酸等選擇性壓力穩(wěn)定質(zhì)粒的手段，往往在大規(guī)模生產(chǎn)中難以應(yīng)用。而采用固定化方法后，這種選擇壓力則可被省去。不同的宿主菌及質(zhì)粒在固定化系統(tǒng)中均表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性。,中試是上游技術(shù)與工業(yè)化生產(chǎn)的連接環(huán)節(jié)，其目的在于考察一個(gè)上游構(gòu)建成功的重組菌種是否適合未來(lái)的產(chǎn)業(yè)化。另外，通過(guò)中試還可以獲得大量的產(chǎn)品供臨床試驗(yàn)，同時(shí)中試所得的相關(guān)培養(yǎng)、發(fā)酵、純化等工藝參數(shù)可以做為生產(chǎn)設(shè)計(jì)時(shí)的參考。,,,第七節(jié)基因工程菌的中試,中試應(yīng)考慮的問(wèn)題：工程菌是否適宜商品化發(fā)酵反應(yīng)器設(shè)計(jì)反應(yīng)過(guò)程選擇發(fā)酵培養(yǎng)條件生產(chǎn)工藝最佳方法優(yōu)化工藝監(jiān)測(cè)方法工藝控制方法工藝自動(dòng)化使用方法生物催化劑使用方法（如果有的話）產(chǎn)品提取方法分離精制技術(shù)等。,一、工程菌選擇：用于中試的工程菌需具備的條件：1、能用一般基因重組技術(shù)獲得2、有高產(chǎn)潛力3、能以工業(yè)原料為培養(yǎng)基，主要是碳源4、生產(chǎn)工藝不復(fù)雜，能一般化5、能產(chǎn)生和分泌蛋白質(zhì)（細(xì)胞外分泌）6、不致病、無(wú)毒性7、能安全生產(chǎn)、符合國(guó)家衛(wèi)生部門規(guī)定8、代謝可控性，產(chǎn)品有特異性9、發(fā)酵液粘度小等,,二、反應(yīng)器（發(fā)酵罐）設(shè)計(jì)符合生物反應(yīng)和化學(xué)工程需要。設(shè)計(jì)基礎(chǔ)：5種生物數(shù)據(jù)－培養(yǎng)細(xì)胞系特性、細(xì)胞生長(zhǎng)率、發(fā)酵罐消毒方法、溫度pH溶氧二氧化碳及代謝產(chǎn)物、后處理效果。設(shè)計(jì)中應(yīng)考慮的問(wèn)題：根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件需要，能連續(xù)發(fā)酵（也可分批發(fā)酵），并附有加料管取料管及測(cè)量?jī)x表，易安裝及移動(dòng)，儀表所得數(shù)據(jù)可靠，數(shù)據(jù)重復(fù)性好，可任意安裝附件，罐體材質(zhì)好并打光，避免殘?jiān)e存。,,三、發(fā)酵培養(yǎng)基組成：1、化學(xué)元素：細(xì)胞生長(zhǎng)必需的碳、氮、氧、氫、磷及一些微量元素和金屬離子。2、特殊營(yíng)養(yǎng)源：氨基酸、維生素等。3、能源：葡萄糖等。4、代謝控制物：生物活性物質(zhì)，或者改變溫度、pH值、誘導(dǎo)菌種改變生長(zhǎng)速度或代謝途徑等，目的為增加產(chǎn)量。注意：工業(yè)化生產(chǎn)用培養(yǎng)基以工業(yè)原料為主，以降低生產(chǎn)成本，所以中試時(shí)就要進(jìn)行培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件探索。,,四、工藝最佳化與參數(shù)監(jiān)測(cè)控制1、工藝最佳化：指最快周期、最高產(chǎn)量、最好質(zhì)量、最低能耗、最大安全性、最周全的廢物處理效果、最佳化速度、最低失敗率等。只有在掌握菌種生物特性和發(fā)酵工藝參數(shù)了如指掌，才能設(shè)計(jì)出最佳生產(chǎn)工藝。2、參數(shù)監(jiān)測(cè)控制：四種需要監(jiān)測(cè)的參數(shù)主要參數(shù)－pH、溫度、溶氧、二氧化碳生物量－渾濁度、細(xì)胞組分、總氮量及菌絲干重。碳源－糖、有機(jī)酸、乙醇、淀粉、脂質(zhì)產(chǎn)品－形成時(shí)間、形式、性狀等全自動(dòng)化控制,,五、計(jì)算機(jī)的應(yīng)用：全自動(dòng)化控制的基礎(chǔ)熱電耦電極－－溫度離子敏感電極－離子pH電極－－－－pH氧化還原電極－還原電位熱量計(jì)－－－－熱平衡可以儲(chǔ)存于計(jì)算機(jī)－通過(guò)計(jì)算機(jī)計(jì)算、對(duì)比、優(yōu)化選擇－提高產(chǎn)品產(chǎn)量與質(zhì)量、降低原材料與能源消耗、降低成本－最終模擬出一個(gè)高產(chǎn)、高質(zhì)、低成本生產(chǎn)工藝最佳化的控制微生物數(shù)學(xué)公式并實(shí)際運(yùn)用。,,,培養(yǎng)工藝是發(fā)酵工藝的重要組成部分，對(duì)外源蛋白的表達(dá)至關(guān)重要，直接影響產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量，從而影響產(chǎn)品成本及市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。最佳的培養(yǎng)工藝還要考慮對(duì)純化工藝的影響。,第八節(jié)基因工程菌的培養(yǎng),,一、基因工程菌的培養(yǎng)方式：1、分批培養(yǎng)：培養(yǎng)基的量一次性加入，產(chǎn)品一次性收獲,分批培養(yǎng)操作簡(jiǎn)單，但因不能控制生長(zhǎng)，獲得的菌體密度也有限。2、補(bǔ)料分批培養(yǎng)：在一次投料發(fā)酵的基礎(chǔ)上，流加一定量的營(yíng)養(yǎng)，使細(xì)胞進(jìn)一步的生長(zhǎng)，可得到更多的代謝產(chǎn)物。3、連續(xù)培養(yǎng)：不斷地流加營(yíng)養(yǎng)，并不斷地取出發(fā)酵液。連續(xù)培養(yǎng)則多用于動(dòng)力學(xué)特性和穩(wěn)定性等研究。4、透析培養(yǎng)：5、固定化培養(yǎng)：,,補(bǔ)料分批培養(yǎng)補(bǔ)料分批培養(yǎng)是將種子接入發(fā)酵反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間，間歇或連續(xù)地補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基，使菌體進(jìn)一步生長(zhǎng)的培養(yǎng)方法。在分批培養(yǎng)中，為保持基因工程菌生長(zhǎng)所需的良好微環(huán)境，延長(zhǎng)其生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，獲得高密度菌體，通常把溶氧控制和流加補(bǔ)料措施結(jié)合起來(lái)，根據(jù)基因工程菌的生長(zhǎng)規(guī)律來(lái)調(diào)節(jié)補(bǔ)料的流加速率。,基因工程菌培養(yǎng)方式,連續(xù)培養(yǎng)連續(xù)培養(yǎng)是將種子接入發(fā)酵反應(yīng)器中，攪拌培養(yǎng)至菌體濃度達(dá)到一定程度后，開動(dòng)進(jìn)料和出料蠕動(dòng)泵，以一定稀釋率進(jìn)行不間斷培養(yǎng)。但是由于基因工程菌的不穩(wěn)定性，連續(xù)培養(yǎng)比較困難。為了解決這一問(wèn)題，人們將工程菌的生長(zhǎng)階段和基因表達(dá)階段分開，進(jìn)行兩階段連續(xù)培養(yǎng)。,基因工程菌培養(yǎng)方式,透析培養(yǎng)透析培養(yǎng)技術(shù)是利用膜的半透性原理使培養(yǎng)物和培養(yǎng)基分離，其主要目的是通過(guò)去除培養(yǎng)液中的代謝產(chǎn)物來(lái)解除其對(duì)生產(chǎn)菌的不利影響。,基因工程菌培養(yǎng)方式,,,,,發(fā)酵液,透析過(guò)的發(fā)酵液,,,透析膜,,乙酸,養(yǎng)分,,代謝產(chǎn)物,,固定化培養(yǎng)基因工程菌培養(yǎng)的一大難題是如何維持質(zhì)粒的穩(wěn)定性。有人將固定化技術(shù)應(yīng)用到這一領(lǐng)域，發(fā)現(xiàn)基因工程菌經(jīng)固定化后，質(zhì)粒的穩(wěn)定性大大提高，便于進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)，特別是對(duì)分泌型菌更為有利。由于這一優(yōu)點(diǎn)，基因工程菌固定化培養(yǎng)研究已得到迅速開展。,基因工程菌的培養(yǎng)方式,二、選擇培養(yǎng)方式必須考慮的因素：1、培養(yǎng)基2、溶解氧3、溫度4、pH5、蛋白表達(dá)相關(guān)因素－表達(dá)時(shí)機(jī)、表達(dá)程序等,,三、基因工程菌的培養(yǎng)設(shè)備,基因工程菌培養(yǎng)是為了獲得最大量的基因表達(dá)產(chǎn)物。由于這類物質(zhì)是相對(duì)獨(dú)立于細(xì)胞染色體之外的重組質(zhì)粒上的外源基因所合成的、細(xì)胞并不需要的蛋白質(zhì)，因此，培養(yǎng)設(shè)備以及設(shè)備控制應(yīng)滿足獲得高濃度的受體細(xì)胞和高效的表達(dá)基因產(chǎn)物。,發(fā)酵罐的組成部分有：發(fā)酵罐體保證高傳質(zhì)作用的攪拌器、精細(xì)的溫度控制和滅菌系統(tǒng)、空氣無(wú)菌過(guò)濾裝置殘留氣體處理裝置參數(shù)測(cè)量與控制系統(tǒng)（如pH、O2、CO2等）培養(yǎng)液配制及連續(xù)操作裝置等。,基因工程菌的培養(yǎng)設(shè)備,基因工程菌在發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中要求環(huán)境條件恒定，不影響其遺傳特性，更不能引起所帶質(zhì)粒丟失。對(duì)發(fā)酵罐有特殊要求如要提供菌體生長(zhǎng)的最適條件培養(yǎng)過(guò)程不得污染保證純菌培養(yǎng)培養(yǎng)及消毒過(guò)程中不得游離出異物，干擾細(xì)菌代謝活動(dòng),基因工程菌的培養(yǎng)設(shè)備,1.發(fā)酵罐的結(jié)構(gòu)材料的穩(wěn)定性要好，一般要應(yīng)用不銹鋼制成2.罐體表面光滑易清洗，滅菌時(shí)沒(méi)有死角3.所有的連接接口均要用密封圈封閉，不留“死腔”，不得有泄漏4.發(fā)酵罐的排氣口須有蒸汽滅菌或微孔濾器除菌后才將廢氣放出。5.攪拌器轉(zhuǎn)速和通氣應(yīng)適當(dāng)6.與發(fā)酵罐連接的閥門要用膜式閥，不用球形閥7.空氣過(guò)濾系統(tǒng)要采用活性碳和玻璃纖維棉材料8.培養(yǎng)液要經(jīng)化學(xué)處理或熱處理后才可排放9.軸封可采用磁力攪拌或雙端面密封,基因工程菌的培養(yǎng)設(shè)備,第十節(jié)基因工程藥物的分離純化,基因工程藥物大部分為多肽或蛋白質(zhì)，其分離、純化非常重要。特點(diǎn)：①目的產(chǎn)物在初始物料中含量較低；②含有大量細(xì)胞及代謝產(chǎn)物；③表達(dá)產(chǎn)物穩(wěn)定性差，易失活變性；④表達(dá)產(chǎn)物的種類繁多、結(jié)構(gòu)不一；⑤成品要求純度高、無(wú)菌、無(wú)熱原。,,一、建立分離純化工藝的依據(jù),⒈含目的產(chǎn)物的起始物料的特點(diǎn)基因工程菌的發(fā)酵產(chǎn)物其上游過(guò)程的各種因素對(duì)分離、純化工藝有影響。包括：①菌種的類型及其代謝特性。②原材料和培養(yǎng)基的來(lái)源及其質(zhì)量。③生產(chǎn)工藝及條件。④初始物料的物理、化學(xué)、生物學(xué)性質(zhì)⒉物料中雜質(zhì)的種類和性質(zhì)⒊目的產(chǎn)物特性⒋產(chǎn)品質(zhì)量的要求,,二、分離純化的基本過(guò)程,發(fā)酵液細(xì)胞分離胞內(nèi)產(chǎn)物胞外產(chǎn)物細(xì)胞破碎固液分離可溶性蛋白包含體細(xì)胞碎片分離變性復(fù)性,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,濃縮初步分離高度純化制劑產(chǎn)品,,,三、分離純化的技術(shù),分離純化的技術(shù)要求：①技術(shù)條件溫和能保持產(chǎn)物生物活性。②選擇性好，能從復(fù)雜的混合物中有效的將目的產(chǎn)物分離，達(dá)到較高的純化倍數(shù)。③收率高、成本低。④兩個(gè)技術(shù)間能直接銜接，不需要對(duì)物料加以處理。⑤純化過(guò)程要快，滿足高生產(chǎn)率的要求。,,⒈細(xì)胞破碎與固液分離⑴細(xì)胞收集：離心法、生物膜分離法。⑵細(xì)胞破碎：是否加外力：機(jī)械破碎法、非機(jī)械破碎法。所用方法屬性：物理法、化學(xué)法、生物法。⑶固液分離：高速離心、膜過(guò)濾、雙相萃取,目的產(chǎn)物含有大量雜質(zhì)必須進(jìn)行分離純化。蛋白質(zhì)分離純化方法的設(shè)計(jì)根據(jù)其分子的理化性質(zhì)和生物學(xué)特性來(lái)決定。,,五、重組蛋白的分離純化,產(chǎn)物特性作用等電點(diǎn)決定離子交換種類及條件相對(duì)分子量選擇不同孔徑的介質(zhì)疏水性與疏水、反相介質(zhì)結(jié)合的程度生物特異性決定親和配基溶解性決定分離體系及蛋白濃度穩(wěn)定性決定工藝采用溫度及流程時(shí)間,,,,,產(chǎn)物的特性：分離純化方法,層析(chromatography)A離子交換層析B疏水層析C親和層析D凝膠過(guò)濾層析,A離子交換層析離子交換層析的基本原理離子交換介質(zhì)的基本性質(zhì)離子交換介質(zhì)的選擇原則,外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離純化方法,離子交換層析的基本原理,離子交換層析是以離子交換劑為固定相，以特定的含離子溶液為流動(dòng)相，利用離子交換劑對(duì)待分離的各種離子結(jié)合力的差異，而將混合物中不同離子進(jìn)行分離的層析技術(shù)。,離子交換劑，通常是一種不溶性高分子化合物如纖維素，葡聚糖，瓊脂糖等；離子交換劑中所含的可解離基團(tuán)在水溶液中能與溶液中的其它陽(yáng)離子或陰離子起交換作用。,離子交換劑,,－,－,－,－,陽(yáng)離子交換劑：強(qiáng)酸型和弱酸型可電離的基團(tuán)磺酸基（-SO3H）磷酸基（-PO3H2）羧酸基（-COOH）酚羥基（-OH）陰離子交換劑：強(qiáng)堿型和弱堿型可電離的基團(tuán)伯胺基（-NH2）仲胺基（-NHCH3）叔胺基（-N(CH3)2）季胺基（-N+(CH3)3）,離子交換劑的分類,常用的離子交換劑離子交換纖維素：離子交換纖維素是攜帶功能基團(tuán)纖維素衍生物，具有松散的親水性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)以及較大的表面積，大分子可以自由通過(guò)，因而對(duì)生物大分子（如蛋白質(zhì)）的交換容量比離子交換樹脂大。陽(yáng)離子型離子交換纖維素包括羥甲基纖維素（CM纖維素）等陰離子型離子交換纖維素包括二乙基氨基乙基纖維素（DEAE纖維素）,常用的離子交換劑離子交換葡聚糖：離子交換葡聚糖是葡聚糖經(jīng)環(huán)氧氯丙烷交聯(lián)后形成的具有多孔三維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和離子交換功能基團(tuán)的多糖衍生物（SephadexG）。常用的離子交換葡聚糖包括：陽(yáng)離子交換劑CM-SephadexC-25CM-SephadexC-50陰離子交換劑DEAE-SephadexA-25DEAE-SephadexA-50,常用的離子交換劑離子交換瓊脂糖：離子交換瓊脂糖是攜帶DEAE或CM基團(tuán)的SepharoseCL-6BDEAE-Sepharose（陰離子型）和CM-Sepharose（陽(yáng)離子型）的離子交換介質(zhì)具有硬度大、性質(zhì)穩(wěn)定，流速好，分離能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。,離子交換介質(zhì)的選擇原則一般而言：酸性物質(zhì)用陰離子交換劑分離堿性物質(zhì)用陽(yáng)離子交換劑分離氨基酸、核苷酸、蛋白質(zhì)等兩性電解質(zhì)，可根據(jù)其pI值及離子化曲線來(lái)選擇,離子交換介質(zhì)的選擇原則,,,,,,,,,,,,,,,1,2,3,4,6,7,8,9,10,5,pH,+,-,蛋白質(zhì)凈電荷,,等電點(diǎn),,,,,吸附陰離子交換劑,吸附陽(yáng)離子交換劑,pHpI（-）,對(duì)pI=5的某酸性蛋白質(zhì)當(dāng)pH5.5-9.0的范圍內(nèi)時(shí)，蛋白質(zhì)為陰離子，應(yīng)首選DEAE纖維素；當(dāng)pH3.5-4.5的范圍內(nèi)時(shí)，蛋白質(zhì)為陽(yáng)離子，應(yīng)首選CM纖維素,B疏水層析,疏水層析（HIC）是根據(jù)分子表面疏水性差別來(lái)分離蛋白質(zhì)和多肽等生物大分子的一種較為常用的方法。疏水性弱的物質(zhì)，在較高離子強(qiáng)度的溶液時(shí)被洗脫下來(lái)，當(dāng)離子強(qiáng)度降低時(shí)，疏水性強(qiáng)的物質(zhì)才隨后被洗脫下來(lái)。,疏水配基,烷基鏈配基,芳基配基,高分子配基,疏水基質(zhì),應(yīng)用最廣泛,良好的生物相容性和化學(xué)穩(wěn)定性,基本操作,,平衡Equilibration上樣Sampleapplication洗雜Washing洗脫Elution,C親和層析親和層析的原理親和層析載體的性質(zhì)與選擇親和層析配基的性質(zhì)與選擇,親和層析的原理親和層析：利用固定化配基與目的蛋白質(zhì)之間特異的生物親和力進(jìn)行吸附，如抗體與抗原、受體與激素、酶與底物之間的作用。配基：在親和層析中起可逆性結(jié)合的特異性物質(zhì)。載體：與配基結(jié)合的支撐物。,親和層析的特點(diǎn)：1.純化過(guò)程簡(jiǎn)單、迅速，且分離效率高；2.特別適用于分離純化一些含量低、穩(wěn)定性差的生物大分子;3.純化倍數(shù)大，產(chǎn)物純度高;4.必須針對(duì)某一分離對(duì)象制備專一的配基及尋求穩(wěn)定的層析條件,因此應(yīng)用范圍受到一定的限制。,常用的親和層析載體纖維素葡聚糖凝膠瓊脂糖凝膠聚丙烯酰胺凝膠其它新型載體,親和層析配基的選擇：純化對(duì)象和配基之間必須有較強(qiáng)的親和力。但親和力太高也是有害的，因?yàn)樵诮怆x配基復(fù)合物時(shí)所需的條件就要強(qiáng)烈，這樣可能使生物分子變性配基必須具有適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)基團(tuán)，這種基團(tuán)不參與配基與生物分子之間特異結(jié)合，但可用于和載體相連，同時(shí)又不影響配基與生物分子之間的親和力。,D凝膠層析凝膠層析的基本原理凝膠介質(zhì)的基本性質(zhì)凝膠介質(zhì)的選用原則,凝膠層析的基本原理凝膠過(guò)濾是以具有大小一定的多孔性凝膠作為分離介質(zhì)，小分子能進(jìn)入孔內(nèi)，在柱中緩慢移動(dòng)，而大分子不能進(jìn)入孔內(nèi)，快速移動(dòng)，利用這種移動(dòng)差別可使大分子與小分子分開。根據(jù)蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量和蛋白質(zhì)分子的動(dòng)力學(xué)體積的大小差異，可以利用凝膠過(guò)濾來(lái)分離純化目的蛋白。,常用的凝膠葡聚糖凝膠（Sephadex）葡聚糖凝膠的種類有G-10，G-15，G-25，G-50，G-75，G-100，G-150，和G-200。G表示葡聚糖，G后面的阿拉伯?dāng)?shù)為凝膠得水值的10倍。例如，G-25為每克凝膠膨脹時(shí)吸水2.5克。G值越小，交聯(lián)度越大，吸水性越小。SephadexLH是羥丙基化的Sephadex，這類層析介質(zhì)的流動(dòng)相既可使用緩沖水溶液，也可使用極性有機(jī)溶劑，因此適用于非水溶性溶質(zhì)的凝膠過(guò)濾。,常用的凝膠瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠是由瓊脂中分離出來(lái)的天然凝膠，常見的有Sepharose和Bio-Gel-A等。瓊脂糖凝膠是一種大孔凝膠，因而適合于分離分子量較大的生物大分子物質(zhì)（如蛋白質(zhì)和DNA）。,常用的凝膠聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠是一種以丙烯酰胺為單位由甲叉雙丙烯酰胺交聯(lián)而成的人工合成凝膠，控制交聯(lián)劑的用量可制成各種型號(hào)的凝膠，交聯(lián)劑越多，孔隙越小。聚丙烯酰胺凝膠的商品名為Bio-Gel，型號(hào)從P-2至P-300共10種（數(shù)字X1000就相當(dāng)于該凝膠的排阻限度）,E膜分離膜分離的基本原理分離膜的主要性能影響膜分離的因素,膜分離的基本原理膜分離的基本定義膜分離是利用膜的選擇性，以膜的兩側(cè)存在一定量的能量差作為推動(dòng)力，由于溶液中各組分透過(guò)膜的遷移速率不同而實(shí)現(xiàn)的分離。,膜分離的基本原理膜分離的主要類型透析（DialysisDS）反滲透（ReverseosmosisRO）超濾（UitrfiltrationUF）微濾（MicrofitrationMF）電滲析（ElectrodialysisEI）,透析（DialysisDS）利用透析袋把大分子蛋白質(zhì)與小分子化合物分開的方法。,分離膜的基本性能膜的分類按膜的孔徑大小分類：微濾膜0.025-14mm超濾膜0.001-0.02mm反滲透膜0.0001-0.001mm納米過(guò)濾膜平均孔徑2nm,分離膜的基本性能膜的分類按膜的孔徑大小分類：天然高分子膜醋酸纖維素、硝酸纖維素、再生纖維素合成聚合物膜聚砜、聚酰胺、聚烯、含氟聚合物無(wú)機(jī)材料膜陶瓷、微孔玻璃、不銹鋼、碳素,蛋白質(zhì)的其它純化方法：離心、鹽析、有機(jī)溶劑沉淀、等電點(diǎn)沉淀雙水相萃取、結(jié)晶，等。注意：一種方法很難達(dá)到完全純化或者產(chǎn)物符合標(biāo)準(zhǔn)，要聯(lián)合幾種方法。,六、非蛋白質(zhì)雜質(zhì)的去除,⑴DNA的去除：DNA在pH4.0以上呈陰離子，蛋白質(zhì)的pI在6.0以上,可用陰離子交換劑吸附除去。如蛋白質(zhì)為強(qiáng)酸性，可選擇條件使其吸附在陽(yáng)離子交換劑上，而DNA不吸附。親和層析和疏水層析也有效。⑵熱原質(zhì)的去除：熱原質(zhì)是腸桿菌科產(chǎn)生的細(xì)菌內(nèi)毒素（脂多糖）去除困難。分子量小的多肽或蛋白質(zhì)中的熱原可用超濾或反滲透，脂多糖是陰離子可用陰離子交換層析除去，脂多糖是疏水性可用疏水層析法。⑶病毒的去除：層析或過(guò)濾可將病毒去除。,,七、選擇分離純化方法的依據(jù),⒈根據(jù)產(chǎn)物表達(dá)形式來(lái)選擇同時(shí)它可以噴入鼻腔或口腔,用來(lái)預(yù)防和治療某些呼吸系統(tǒng)疾病,如感冒、口唇皰疹、SARS等.,復(fù)習(xí),1.基因工程藥物制備的一般過(guò)程。2.利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)藥品的優(yōu)點(diǎn)有哪些？3.獲得目的基因常用的三種方法是（）、（）和（）。,作業(yè)1、表達(dá)載體必須具備的條件有哪些？2、影響目的基因在大腸桿菌中表達(dá)的因素有哪些？,1、質(zhì)粒不穩(wěn)定分為哪兩類?2、如何解決質(zhì)粒不穩(wěn)定性？,對(duì)由基因重組技術(shù)所獲得的蛋白質(zhì)藥物產(chǎn)品進(jìn)行鑒定時(shí)，常做哪些項(xiàng)目分析？,答：1.生物活性測(cè)定：2.理化性質(zhì)測(cè)定：3.蛋白質(zhì)含量4.蛋白質(zhì)純度分析5.雜質(zhì)檢測(cè)6.穩(wěn)定性考查：7.產(chǎn)品一致性的保證：,,,第三章動(dòng)物細(xì)胞工程制藥,第一節(jié)概述,細(xì)胞學(xué)說(shuō)的建立：組織培養(yǎng)：早期培養(yǎng)形式，細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)：生物體內(nèi)某一塊組織取出，用酶消化分散成單個(gè)細(xì)胞，然后接種到特定的培養(yǎng)容器中并給予必要的培養(yǎng)條件，進(jìn)行體外生長(zhǎng)繁殖的培養(yǎng)方式。（營(yíng)養(yǎng)對(duì)理化因素敏感，如：滲透壓、pH、離子濃度、剪切力、微量元素等。⒌動(dòng)物細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基要求高必需氨基酸、維生素、無(wú)機(jī)鹽、微量元素、葡萄糖、細(xì)胞生長(zhǎng)因子、貼壁因子等。,⒍動(dòng)物細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成途徑和修飾功能與細(xì)菌不同。動(dòng)物細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成部位：游離核糖體：合成的蛋白質(zhì)用于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)內(nèi)。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的核糖體：合成蛋白質(zhì)是分泌的和膜中的整合蛋白，多為糖蛋白。,動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)藥物缺點(diǎn):培養(yǎng)條件高、成本貴、產(chǎn)量低。優(yōu)點(diǎn):分泌胞外、純化方便、翻譯后修飾糖基化，與天然產(chǎn)品一致。,第三節(jié)生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的要求和獲得,一、生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的要求原代細(xì)胞二倍體細(xì)胞異倍體細(xì)胞,,二、生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的獲得,⒈原代細(xì)胞是直接取自動(dòng)物組織器官，經(jīng)過(guò)粉碎消化而獲得的細(xì)胞懸液（109/g）。需要大量動(dòng)物，費(fèi)錢費(fèi)勞力。雞胚細(xì)胞、原代兔腎細(xì)胞、鼠腎細(xì)胞、淋巴細(xì)胞。,⒉二倍體細(xì)胞系（細(xì)胞株cellstrain）原代細(xì)胞經(jīng)過(guò)傳代篩選克隆，從多種細(xì)胞成分的組織中，挑選并純化出某種具有一定特征的細(xì)胞株。二倍體細(xì)胞是正常細(xì)胞，其特點(diǎn)：①染色體組型是2n核型；②貼壁依賴、接觸抑制；③可傳代培養(yǎng)50代；④無(wú)致瘤性。,⒊轉(zhuǎn)化細(xì)胞系通過(guò)某個(gè)轉(zhuǎn)化過(guò)程形成的，常由于染色體斷裂變成異倍體，失去正常細(xì)胞特點(diǎn)，而獲得無(wú)限增殖能力。轉(zhuǎn)化過(guò)程可以是自發(fā)的和人工的。由于轉(zhuǎn)化細(xì)胞具有無(wú)限生命力，而且常常倍增時(shí)間較短，對(duì)培養(yǎng)條件和生長(zhǎng)因子等要求較低，故更適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的需要。,4.融合細(xì)胞系細(xì)胞融合是指兩個(gè)或兩個(gè)以上的細(xì)胞合并成一個(gè)細(xì)胞的過(guò)程。細(xì)胞融合的發(fā)生方式：自然融合、誘發(fā)融合。,常見融合方法：生物學(xué)方法－病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合：仙臺(tái)病毒介導(dǎo)。誘導(dǎo)融合過(guò)程：,獲得滅活仙臺(tái)病毒和細(xì)胞,4℃下細(xì)胞與足夠量仙臺(tái)病毒孵育，使病毒顆粒吸附在細(xì)胞膜上的相應(yīng)受體位點(diǎn)，促成細(xì)胞緊密靠近，粘附成團(tuán),兩細(xì)胞合并、變圓、融合,37℃下粘結(jié)部位細(xì)胞膜的有序排列發(fā)生改變，形成通道,細(xì)胞質(zhì)互相滲透并融合,,,,,化學(xué)方法－PEG誘導(dǎo)細(xì)胞融合PEG（聚乙二醇）是一種多聚化合物，分子末端帶有弱電性，易溶于水。實(shí)驗(yàn)室常用PEG分子量在200－20000。PEG誘導(dǎo)細(xì)胞融合是20世紀(jì)70年代發(fā)展起來(lái)的細(xì)胞融合技術(shù)，最初用于植物原生質(zhì)體融合，后用于動(dòng)物細(xì)胞融合。融合效率與分子量和濃度有關(guān)。優(yōu)點(diǎn)：是融合成本低，勿需特殊設(shè)備；融合子產(chǎn)生的異核率較高；融合過(guò)程不受物種限制。缺點(diǎn)：PEG可能對(duì)細(xì)胞有毒害。,物理學(xué)方法－電誘導(dǎo)細(xì)胞融合：利用電誘導(dǎo)細(xì)胞融合，是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來(lái)的細(xì)胞融合技術(shù)。原理：在脈沖電場(chǎng)作用下，細(xì)胞間緊接區(qū)域同時(shí)形成可逆電擊穿（即形成細(xì)胞膜電穿孔），緊密接觸部位的細(xì)胞膜形成膜橋和質(zhì)橋連接，繼而發(fā)生細(xì)胞融合，在一定條件下電穿孔自行修復(fù)，細(xì)胞膜恢復(fù)正常結(jié)構(gòu)。優(yōu)點(diǎn)：融合率高、重復(fù)性強(qiáng)、對(duì)細(xì)胞傷害??；裝置精巧、方法簡(jiǎn)單、可在顯微鏡下觀察或錄像觀察融合過(guò)程；免去PEG誘導(dǎo)后的洗滌過(guò)程、誘導(dǎo)過(guò)程可控性強(qiáng)。缺點(diǎn)：儀器較貴重,融合細(xì)胞的克隆化：目的：利用單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)的技術(shù)選育出遺傳穩(wěn)定的，能表達(dá)特定性狀的細(xì)胞系。方法：有限稀釋法、半固體培養(yǎng)基法、顯微操作法、熒光激活分選法。1）有限稀釋法：通過(guò)適當(dāng)?shù)南♂屵_(dá)到分離單個(gè)細(xì)胞的目的。（細(xì)胞計(jì)數(shù)——培養(yǎng)液稀釋后微孔板培養(yǎng)——基本一孔一細(xì)胞——生成集落后檢測(cè)——再次克隆化——單細(xì)胞克隆）2）半固體培養(yǎng)基法：在半固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞，單細(xì)胞可以形成集落，然后吸出集落移種擴(kuò)增。3）顯微操作法：借助倒置顯微鏡，用彎頭毛細(xì)管將細(xì)胞逐個(gè)吸出，分別進(jìn)行培養(yǎng)，形成單細(xì)胞集落。4）熒光激活分選法：應(yīng)用熒光激活分選儀進(jìn)行。,5、重組工程細(xì)胞系,（一）、重組細(xì)胞：特指利用基因工程手段制做的表達(dá)外源蛋白的細(xì)胞。（二）、重組細(xì)胞的構(gòu)建過(guò)程：,獲得插入外源基因的表達(dá)載體,轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞,鑒定、篩選含有外源基因的細(xì)胞株,酶切、連接,,,（三）、克隆化基因在哺乳動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞中的表達(dá)：優(yōu)點(diǎn)：對(duì)于真核蛋白，能進(jìn)行翻譯后修飾，保持表達(dá)蛋白的活性、穩(wěn)定性、及抗原性。缺點(diǎn)：操作復(fù)雜、條件苛刻、費(fèi)用較高。,哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因表達(dá)控制元件：（1）啟動(dòng)子：包含兩種識(shí)別序列，TATAbox及上游啟動(dòng)子元件。啟動(dòng)子上具有mRNA的帽區(qū)位點(diǎn)即轉(zhuǎn)錄起始部位。（2）增強(qiáng)子元件：順式作用的DNA序列，約100－200bp。特征：是一種較大元件，可包含重復(fù)序列，可獨(dú)立發(fā)揮功能可距啟動(dòng)子很遠(yuǎn)將其活化，作用與序列方向無(wú)關(guān)；發(fā)揮作用為位置不依賴方式，具有組織特異性；有些增強(qiáng)子是條件誘導(dǎo)型的。,,三、基因工程細(xì)胞的構(gòu)建和篩選,（3）、翻譯起始信號(hào)與終止信號(hào)：AUG；UAA、UAG、UGA，poly(A)。（4）、剪接信號(hào)：RNA轉(zhuǎn)錄后修飾過(guò)程，切除內(nèi)含子。,載體系統(tǒng)：（1）SV40（猿空泡病毒40）載體：含有SV40復(fù)制起點(diǎn)，有功能性SV40早期或晚期啟動(dòng)子的載體。特征：1.可以在多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞中獲得從低水平到高水平的表達(dá)，轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞可獲較高水平表達(dá)。2.可表達(dá)基因組DNA，也可表達(dá)cDNA，插入大小不限。3.一般作為短時(shí)表達(dá)系統(tǒng)。4.多帶有剪接供體和受體信號(hào)。5.帶有SV40復(fù)制起點(diǎn)、加尾信號(hào)及宿主范圍廣泛的啟動(dòng)子。,（四）、表達(dá)系統(tǒng)：1、哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)：2、昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)：3、果蠅細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)：,（五）、重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞的方法1、磷酸鈣介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)染：促進(jìn)DNA的內(nèi)吞作用（短時(shí)表達(dá)）。2、脂質(zhì)體介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)染：脂質(zhì)體與膜質(zhì)性質(zhì)類似，可以與膜質(zhì)融合。當(dāng)DNA被包裹于脂質(zhì)體內(nèi)后，脂質(zhì)體與細(xì)胞膜融合將DNA帶入細(xì)胞內(nèi)（短時(shí)表達(dá)）。3、基因的電穿孔轉(zhuǎn)移：通過(guò)對(duì)細(xì)胞施加短暫、高壓的脈沖電流，使細(xì)胞膜穿孔，DNA可直接進(jìn)入胞質(zhì)甚至胞核中。4、顯微注射：顯微條件下，直接將DNA注入細(xì)胞核。5、基因槍：使包裹于金粉上的DNA通過(guò)基因槍轟擊受體細(xì)胞而進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中。,結(jié)語(yǔ)：隨著對(duì)真核細(xì)胞內(nèi)基因產(chǎn)物的功能、調(diào)節(jié)和相互作用機(jī)制的深入了解和新技術(shù)的出現(xiàn)，使得真核細(xì)胞成為最有吸引力的商業(yè)化生物活性蛋白生產(chǎn)的宿主細(xì)胞。真核細(xì)胞表達(dá)外源蛋白可以進(jìn)行翻譯后修飾的特點(diǎn)，也使其成為表達(dá)此類蛋白的必不可少的工具。但真核細(xì)胞培養(yǎng)復(fù)雜、環(huán)境要求高、成本高等缺點(diǎn)限制了其使用。另外，目前所用的宿主細(xì)胞生理學(xué)基本信息知之甚少，也影響了其廣泛使用。所以，深入研究宿主細(xì)胞特性、提高轉(zhuǎn)染外源基因拷貝數(shù)的機(jī)制以及詳細(xì)研究維持細(xì)胞穩(wěn)定性的機(jī)制，將為高效利用真核細(xì)胞作為表達(dá)宿主開辟?gòu)V闊前景。,三、常用生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的特性,W1-38：正常胚肺組織人二倍體細(xì)胞系。核型為2n=46。成纖維細(xì)胞，能產(chǎn)生膠原。培養(yǎng)基用BME（Eagle’Basalmedium）。10%小牛血清，pH7.2,同工酶為G6PDB型。倍增時(shí)間為24h，有限壽命50代。安全，用于制備疫苗。,CHO-K1：從中國(guó)地鼠卵巢中分離的上皮樣細(xì)胞。核型：2n=20～22。培養(yǎng)基：DEME培養(yǎng)基，加0.1mmol/L次黃嘌呤，0.1mmol/L胸苷，10%小牛血清，脯氨酸。Namalwa：從肯尼亞患有淋巴瘤病人獲取，建成的人的類淋巴母細(xì)胞。2.8%的高倍體率，12～14條標(biāo)記染色體。單條X，無(wú)Y。培養(yǎng)基為RPMI1640，添加7%胎牛血清。用于生產(chǎn)α干擾素。,Vero：從正常成年非洲綠猴腎臟分離的。為貼壁依賴的成纖維細(xì)胞，核型2n=60；培養(yǎng)基為199培養(yǎng)基，加5%胎牛血清；用于增殖病毒，包括多瘤病毒、脊髓灰質(zhì)炎、狂犬病毒。BHK-21:從5只無(wú)性別的生長(zhǎng)1天的地鼠幼鼠腎臟中分離的;成纖維樣細(xì)胞,核型為2n=44;培養(yǎng)基為DMEM加7%胎牛血清。用于增殖病毒，包括多瘤病毒、口蹄疫病毒、狂犬病毒等并制作疫苗，現(xiàn)已用于工程細(xì)胞構(gòu)建。用于增殖病毒，包括多瘤病毒、口蹄疫病毒、狂犬病毒等并制作疫苗，現(xiàn)已用于工程細(xì)胞構(gòu)建。,MRC-5：從正常男性肺組織中獲得的人二倍體細(xì)胞系。核型為2n=46。屬成纖維細(xì)胞。培養(yǎng)基用DEME加小牛血清。同工酶G6PDB型。有限壽命42～46代。增殖速度較W1-38快。對(duì)