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1、實驗八 SDS聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳分離蛋白質(zhì),,一、目的要求,1.學習電泳原理和技術 2.學習和掌握SDS聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳分離蛋白質(zhì)技術,二、原理 聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺(acrylamide，簡稱Acr)和交聯(lián)劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺(N，Nmethylene-bisacylamide，簡稱Bis)在加速劑N，N，N，N四甲基乙二胺(N，N，N，Ntetramethyl ethylenedia mine，簡稱TEMED)和催化劑過硫酸銨(ammonium persulfate (NH4)2S2O8，簡稱AP)或核黃素(ribofavin即vita min B2，C17H2

2、0O6N4)的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis，簡稱PAGE)。,聚丙烯酰胺凝膠有下列特性： (1)在一定濃度時，凝膠透明，有彈性，機械性能好； (2)化學性能穩(wěn)定，與被分離物不起化學反應，在很多溶劑中不溶； (3)對pH和溫度變化較穩(wěn)定； (4)幾乎無吸附和電滲作用，只要Acr純度高，操作條件一致，則樣品分離重復性好； (5)樣品不易擴散，且用量少，其靈敏度可達10-6g (6)凝膠孔徑可調(diào)節(jié)，根據(jù)被分離物的分子量選擇合適的濃度，通過改變單體及交聯(lián)劑的濃度調(diào)節(jié)凝膠的孔徑； (

3、7)分辨率高，尤其在不連續(xù)凝膠電泳中，集濃縮、分子篩和電荷效應為一體。因而較醋酸纖維薄膜電泳、瓊脂糖電泳等有更高的分辨率。,凝膠濃度(T)的選擇與被分離物質(zhì)分子量密切相關。 表3.4 分子量范圍與凝膠濃度的關系 分子量范圍 適用的凝膠濃度/(%) 蛋 白 質(zhì) 104 20-30 1-4104 15-20 1-5104-1105 10-15 1105 5-10 5105 2-5 核酸(RNA) 104 1520 104105 5-10 105-2106 2-

4、2.6,,,,,,聚丙烯酰胺凝膠電泳分為連續(xù)系統(tǒng)與不連續(xù)系統(tǒng)兩大類。 目前常用的多為圓盤電泳(如圖1)和板狀電泳(如圖2)，兩者電泳原理完全相同。,圖1 聚丙烯酰胺凝膠圓盤電泳示意圖(A為正面,B為剖面)(1)樣品膠pH6.7 (2)濃縮膠pH6.7 (3)分離膠pH8.9 (4)電極緩沖液pH8.3,圖2 夾心垂直板電泳槽示意圖 圖3 凝膠模示意圖1.樣品槽模板 2.長玻璃板 1.導線接頭 2.下貯槽 3.凹形橡膠框 4.樣品槽模板 5.固定螺絲 6.上貯槽 7.冷凝系統(tǒng),返回,不連續(xù)體系由電極緩沖液、濃縮膠及分離膠所組成。濃縮膠是由AP催化聚合而成的大孔膠，凝膠緩沖液為pH6.7的Tr

5、is-HC1。分離膠是由AP催化聚合而成的小孔膠，凝膠緩沖液為pH8.9 Tris-HC1。電極緩沖液是pH8.3 Tris-甘氨酸緩沖液。2種孔徑的凝膠、2種緩沖體系、3種pH值使不連續(xù)體系形成了凝膠孔徑、pH值、緩沖液離子成分的不連續(xù)性，這是樣品濃縮的主要因素。,（1）樣品濃縮效應 (a)凝膠孔徑不連續(xù)性： (b)緩沖體系離子成分及pH值的不連續(xù)性； 在pH6.7的凝膠緩沖體系中 前導離子或快離子：HC1解離出的氯根(C1-) 尾隨離子(trailing ion)或慢離子：甘氨酸根 mclclmppmGG(Cl代表氯根，P代表蛋白質(zhì)，G代表甘氨酸根)有效遷移率=m，m為遷移率，為解離度)

6、當進入pH8.9的分離膠時，甘氨酸解離度增加，其有效遷移率超過蛋白質(zhì)； （c)電位梯度的不連續(xù)性： (2)分子篩效應 (3)電荷效應,圖4 電泳過程示意圖A為電泳前3層凝膠排列順序，3層膠中均有快離子，慢離子B顯示電泳開始后，蛋白質(zhì)樣品夾在快、慢離子之間被濃縮成極窄的區(qū)帶。C顯示蛋白質(zhì)樣品分離成數(shù)個區(qū)帶。,圖5 不連續(xù)系統(tǒng)濃縮效應示意圖,SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE） ：蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠電泳時，它的遷移率取決于它所帶凈電荷以及分子的大小和形狀等因素。如果在丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中加入陰離子去污劑十二烷基磺酸鈉(sodium dodecyl sulfate,簡稱SDS)，則蛋白質(zhì)分

7、子的電泳遷移率主要取決于它的分子量，而與所帶電荷和形狀無關。因此可以利用SDS-PAGE測定蛋白質(zhì)分子量。,三、試劑與器材 試劑：10%SDS、 凝膠貯液（30ACr-0.8%Bis)、分離膠緩沖液（3.0 mol/L pH8.9TrisHCl 緩沖液）、 濃縮膠緩沖液（ 0.5 mol/L pH6.7TrisHCl 緩沖液）、10%過硫酸銨、 10%TEMED、 pH8.3Tris-Gly電極緩沖液、 1%瓊脂糖溶液、0.05考馬斯亮蘭R250 、7%醋酸 器材：垂直板電泳槽、穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 、脫色搖床,五、 操作方法 1.安裝夾心式垂直板電泳槽 (1)裝上貯槽和固定螺絲銷釘，仰放在桌面上

8、。 (2)將長、短玻璃板分別插到凵形硅橡框的凹形槽中，注意勿用手接觸灌膠面的玻璃。 (3)將已插好玻璃板的凝膠模平放在上貯槽上，短玻璃板應面對上貯槽。 (4)將下貯槽的銷孔對準已裝好螺絲銷釘?shù)纳腺A槽，雙手以對角線的方式旋緊螺絲帽。 (5)豎直電泳槽，在長玻璃板下端與硅膠模框交界的縫隙內(nèi)加入已融化的1%瓊脂(糖)。其目的是封住空隙，凝固后的瓊脂(糖)中應避免有氣泡。,3. 制備凝膠板 將混合后的分離膠溶液，用細長頭的滴管加至長、短玻璃板間的窄縫內(nèi)，加膠高度距樣品模板梳齒下緣約1 cm。用1 mL注射器在凝膠表面沿短玻璃板邊緣輕輕加一層重蒸水(約34 mm)，用于隔絕空氣，使膠面平整。 約30-6

9、0 min凝膠完全聚合，則可看到水與凝固的膠面有折射率不同的界線。 將上、下貯槽的蒸餾水倒去 ，將混合均勻后的濃縮膠溶液，用細長頭的滴管加到長、短玻璃板的窄縫內(nèi)(即分離膠上方)，距短玻璃上緣0.5 cm處，輕輕加入樣品槽模板.在上、下貯槽中加入蒸餾水，但不能超過短玻璃板上緣。靜置電泳槽，10 min左右，上膠即可聚合，再放置10-20 min，加入電極緩沖液，使液面沒過短玻璃板約0.5 cm，輕輕取出樣品槽模板，即可加樣。,4. 樣品的處理及加樣 將樣品按0.51 mg/mL加樣品溶解液，溶解后，將其轉(zhuǎn)移到帶塞的小離心管中，輕輕蓋上蓋子(不要塞緊，以免加熱時迸出)，在100沸水浴中加熱3min

10、，取出冷卻后加樣。 用微量進樣器取25 l上述混合液，通過緩沖液，小心地將樣品加到凝膠凹形樣品槽底部。,5 .電泳 將電泳儀的正極與下槽連接，負極與上槽連接，接通冷卻水，打開電泳儀開關，開始時電流為10 mA，待樣品進入分離膠后，將電流調(diào)至20-30 mA，當溴酚藍染料距硅膠框1 cm時，停止電泳，關閉電源及冷卻水。 6 .染色與脫色 電泳結(jié)束后，取下凝膠模，卸下硅膠框，用不銹鋼藥鏟或鑷子撬開短玻璃板，從凝膠板上切下一角作為加樣標記，在兩側(cè)溴酚藍染料區(qū)帶中心，插入細銅絲作為前沿標記。加入染色液染色1-2 h，再用脫色液脫色，直至蛋白質(zhì)區(qū)帶清晰，即可計算相對遷移率。,7. 結(jié)果處理 量出加樣端距細銅絲間的距離(cm)以及各蛋白質(zhì)樣品區(qū)帶中心與加樣端的距離(cm)，按下式計算相對遷移率mR: 相對遷移率mR=,,蛋白質(zhì)樣品距加樣端遷移距離(cm) 溴酚藍區(qū)帶中心距加樣端距離(cm),六、注意事項 （1）安裝電泳槽時要注意均勻用力旋緊固定螺絲，避免緩沖液滲漏。 （2）用瓊脂(糖)封底及灌膠時不能有氣泡，以免電泳時影響電流的通過。 （3）樣品中應含一定濃度的蔗糖溶液，目的是用以防止樣品因?qū)α鞫幌♂尅?（4）加樣時樣品不能超出凹形樣品槽。加樣槽中不能有氣泡，如有氣泡，可用注射器針頭挑除。,七、思考題 (1)為什么要在樣品中加少許溴酚蘭和一定濃度的蔗糖溶液？蔗糖及溴酚蘭的作用分別是什么？,