單擊此處編輯母版標(biāo)題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級(jí),第三級(jí),第四級(jí),第五級(jí),*,*,*,第四講 細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞工程與顯微操作技術(shù),（一）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng),從機(jī)體取出立即培養(yǎng)的細(xì)胞叫原代細(xì)胞（10代）。,將原代細(xì)胞分離、稀釋接種到新的培養(yǎng)中繼續(xù)培養(yǎng)的細(xì)胞為傳代細(xì)胞。,從原代培養(yǎng)細(xì)胞中分離出來(lái)的可繼續(xù)傳代繁殖到4050的細(xì)胞群體叫細(xì)胞株，細(xì)胞具有接觸抑制的行為，有些具有貼壁生長(zhǎng)的行為，具有正常的遺傳物質(zhì)。,從原代細(xì)胞或細(xì)胞株中獲得的可無(wú)限傳代的細(xì)胞叫細(xì)胞系。細(xì)胞無(wú)接觸抑制行為，且具有遺傳突變，帶有癌細(xì)胞的特征。,一、細(xì)胞培養(yǎng),細(xì)胞培養(yǎng)就是將動(dòng)植物組織或細(xì)胞從機(jī)體取出，分散成單個(gè)細(xì)胞 或直接以單細(xì)胞 生物，給予必要的生長(zhǎng)條件，讓其在培養(yǎng)瓶中或培養(yǎng)基上繼續(xù)生長(zhǎng)與增殖。,（二）,動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)即,單克隆抗體技術(shù),1975年英國(guó)學(xué)者M(jìn)ilestein等開創(chuàng)了將產(chǎn)生抗體的單個(gè)細(xì)胞同瘤細(xì)胞雜交的技術(shù)。他們的設(shè)計(jì)是經(jīng)綿羊紅細(xì)胞免疫過(guò)的小鼠脾細(xì)胞(B淋巴細(xì)胞)與骨髓瘤細(xì)胞融合，融合的雜交瘤具有兩種親本細(xì)胞的特性即可分泌抗綿羊紅細(xì)胞的抗體，又可無(wú)限增殖。學(xué)者們紛紛利用這 一技術(shù)來(lái)制備針對(duì)不同抗原的高度純一的單克隆抗體。,單克隆抗體,就是單個(gè)雜交瘤細(xì)胞增殖產(chǎn)生的克隆細(xì)胞群分泌的高度純一的抗體。,動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)即單克隆抗體技術(shù),骨髓瘤細(xì)胞？,體外培養(yǎng),從培養(yǎng)液中獲取,抗原？,淋巴細(xì)胞？,體內(nèi)培養(yǎng),從腹水中提取,單克隆抗體,細(xì)胞融合,、篩選,雜交瘤細(xì)胞,細(xì)胞培養(yǎng),（三）植物細(xì)胞培養(yǎng),1、單倍體細(xì)胞培養(yǎng)：花藥離體培養(yǎng)。（秋水仙素）,2、原生質(zhì)體培養(yǎng)：去壁的植物細(xì)胞叫原生質(zhì)體。可培養(yǎng)成植株或體細(xì)胞雜交植株。,植物組織培養(yǎng),植物體細(xì)胞雜交,過(guò)程,離體的植物器官、組織或細(xì)胞,愈傷組織,根、芽,植物體,外植體,脫分化,植物激素：,細(xì)胞分裂素、生長(zhǎng)素,再分化,植物組織培養(yǎng),植物組織培養(yǎng)條件,：,含有全部營(yíng)養(yǎng)成分的培養(yǎng)基、一定的溫度、空氣、無(wú)菌環(huán)境、適合的PH、適時(shí)光照等。,植物A細(xì)胞,植物B細(xì)胞,去壁,原生質(zhì)體A,原生質(zhì)體B,原生質(zhì)體融合,融合體,再生壁,雜種細(xì)胞,細(xì)胞分裂,愈傷組織,雜種植株,去壁的常用方法：,酶解法（纖維素酶、果膠酶等）,原生質(zhì)體融合方法,：,物理法：離心、振動(dòng)、電刺激等,化學(xué)法：聚乙二醇（PEG）,植物體細(xì)胞雜交,過(guò)程示意圖,三、非細(xì)胞體系在細(xì)胞生物學(xué)研究中的作用,來(lái)源于細(xì)胞，而不具有完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，但包含了正常生物學(xué)反應(yīng)所需的物質(zhì)（供能系統(tǒng)和酶反應(yīng)體系等）組成的體系即為非細(xì)胞體系。,四、細(xì)胞工程,應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)方法，按照預(yù)先的設(shè)計(jì)，有計(jì)劃地改變或創(chuàng)造細(xì)胞遺傳物質(zhì)的技術(shù)以及發(fā)展這種技術(shù) 的領(lǐng)域?yàn)榧?xì)胞工程。,細(xì)胞工程所使用的技術(shù)主要是細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞分化的定向誘導(dǎo)、細(xì)胞融合和顯微注射等。,（一）細(xì)胞融合與細(xì)胞雜交技術(shù),真核生物的體細(xì)胞經(jīng)過(guò)培養(yǎng)，兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞融 合成一個(gè)雙核或多核細(xì)胞的過(guò)程叫細(xì)胞融合。,動(dòng)物細(xì)胞融合一般要用滅活的病毒(如仙臺(tái)病毒)或 化學(xué)物質(zhì)(如聚乙二醇，即PEG）介導(dǎo)；植物細(xì)胞事例時(shí)，要用纖維素酶去掉纖維素壁,。,20世紀(jì)80年代又發(fā)明了電融合技術(shù)。,細(xì)胞融合可以在基因型相同的細(xì)胞間進(jìn)行，也可以在基因型不同的種內(nèi)細(xì)胞間甚至種間細(xì)胞間進(jìn)行。,（二）細(xì)胞折合與顯微操作技術(shù),細(xì)胞拆合就是用物理方法（機(jī)械法和短波光）、化學(xué)法（用細(xì)胞松弛素）把細(xì)胞核與質(zhì)分離開后將不同來(lái)源的細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核相互配合，形成核質(zhì)雜交細(xì)胞。,顯微操作技術(shù)：即在顯微鏡下用顯微操作裝置對(duì)細(xì)胞進(jìn)行解剖和微量注射的技術(shù)。,第四講 細(xì)胞膜與細(xì)胞表面,第一節(jié) 細(xì)胞膜與細(xì)胞表面特化結(jié)構(gòu),細(xì)胞膜又稱質(zhì)膜，是圍繞在細(xì)胞最外層，由膜脂和膜蛋白構(gòu)成。,一、細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)模型,流動(dòng)鑲嵌模型,1925年Gorter（歐文頓）等人提出質(zhì)膜由雙層脂分子構(gòu)成。,1935年Danielli和Davson提出三夾板模型。,1959年Robertson（羅伯特森）提出單位膜模型。,1972年,Singer（桑格）和 Nicolson（尼克森）提出流動(dòng)鑲嵌模型。該模型主要強(qiáng)調(diào)膜的流動(dòng)性；膜蛋白的分布不對(duì)稱性；這是生物膜的基本特征。,根據(jù)已有的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，,生物膜具有如下共同特征,：鑲嵌性。膜的基本結(jié)構(gòu)由脂雙層分子層鑲嵌蛋白構(gòu)成，雙層脂分子以疏水性尾部相對(duì)，極性頭部朝向水 相。,流動(dòng)性,。蛋白質(zhì)和類脂分子具有相對(duì)側(cè)向流動(dòng)性，,不對(duì)稱性,。膜兩側(cè)的分子性質(zhì)和結(jié)構(gòu)不同。蛋白質(zhì)極性。多肽鏈的極性區(qū)突向膜表面，非極性部位埋在脂雙層內(nèi)。,二、細(xì)胞膜（質(zhì)膜）的成分,（一）,膜脂,：主要包括磷脂、糖脂、膽固醇三種,類型。,1、磷脂：甘油磷脂和鞘磷脂（C、H、O、N、P）,磷脂構(gòu)成了膜脂的基本成分，由極性頭部和兩條疏水尾部組成，為雙極性分子（由極性頭部和兩條疏水尾部組成，為雙極性分子）。,2、糖脂：,為鞘氨醇的衍生物。含17個(gè)糖殘基。,3、膽固醇和中性脂質(zhì)：,膽固醇主要存在于動(dòng)物細(xì)胞，可調(diào)節(jié)膜的流動(dòng)性、增加膜的穩(wěn)定性及降低水溶性物質(zhì)的通透性。某些細(xì)菌含有中性脂類。,4、膜脂的運(yùn)動(dòng)方式,膜脂分子的熱運(yùn)動(dòng)方式：1、側(cè)向運(yùn)動(dòng)；2、自旋運(yùn)動(dòng)；3、尾部擺動(dòng)；4、翻轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)。,（二）膜蛋白,1、類型：,膜周邊蛋白和膜內(nèi)在蛋白兩類：,。,外在膜蛋白為水溶性蛋白，分布在膜表面，與膜結(jié)合較疏松，用溫和的方法就可從膜上分離下來(lái)，膜結(jié)構(gòu)并不被破壞。內(nèi)在蛋白多為跨膜蛋白，也有些插入脂雙層中，與脂雙層分子結(jié)合緊密。只有用去垢劑使膜崩解后才可分離出。,2、膜內(nèi)在蛋白與膜脂結(jié)合的方式：主要方式有3種,內(nèi)在膜蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域是與膜脂結(jié)合的主要部位。具體作用方式為：,跨膜結(jié)構(gòu)域含有20個(gè)左右的疏水氨基酸殘基形成螺旋，其外部疏水側(cè)鏈通過(guò)范德華力與脂雙層分相互作用。,某些螺旋的外側(cè)是非極性鏈，內(nèi)側(cè)極性鏈，形成特異極性分子的跨膜通道。,某些跨膜蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域常常僅有1012個(gè)氨基酸殘基形成 折疊結(jié)構(gòu)。,3、,膜蛋白的分離：去垢劑,是分離與研究膜蛋白的常用試劑，可使細(xì)胞膜分解。,去垢劑有離子型去垢劑(如SDS)和非離子去垢劑(Triton x100),。,三、膜的的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：,（一）,流動(dòng)性,1、膜脂的流動(dòng)：膜脂的流動(dòng)性主要指脂分子的側(cè)向運(yùn)動(dòng)。,膜蛋白的運(yùn)動(dòng):,（二）膜的不對(duì)稱性,2、膜脂的不對(duì)稱性,是指膜脂分子在膜的脂雙層中呈不均勻分布，尤其糖脂的分布表現(xiàn)出完全不對(duì)稱性（在質(zhì)膜的外表面）。,3、膜蛋白的不對(duì)稱性,膜蛋白的不對(duì)稱性主要指每種膜蛋白分子(受體、載體蛋白）在細(xì)胞膜上都具有明確的方向性。,各種生物膜的特征及其生物學(xué)功能主要由膜蛋白來(lái)決定的,。,四、細(xì)胞膜的功能,細(xì)胞質(zhì)膜的主要功能：,為細(xì)胞的生命活動(dòng)提供相對(duì)穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境；,選擇性的物質(zhì)運(yùn)輸并伴隨著能量的傳遞；,細(xì)胞識(shí)別與信息傳遞；,為多種酶提供結(jié)合位點(diǎn)；,介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與基質(zhì)這間的連接；,參與形成細(xì)胞表面特化結(jié)構(gòu)。,骨架與細(xì)胞表面的特化結(jié)構(gòu),細(xì)胞表面的,特化結(jié)構(gòu)包括膜骨架、鞭毛、纖毛、變形足和微絨毛等，,它們都是細(xì)胞質(zhì)膜與膜內(nèi)細(xì)胞骨架纖維形成的復(fù)合結(jié)構(gòu)，分別于維持細(xì)胞的形態(tài)、細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞與環(huán)境的物質(zhì)交換等功能有關(guān)。,（一）膜骨架,膜骨架是指細(xì)胞質(zhì)膜下與膜蛋白相連的由,纖維蛋白組成的網(wǎng)架結(jié)構(gòu),，它參與維持細(xì)胞質(zhì)膜的形狀并協(xié)助完成多種功能。,紅細(xì)胞的膜骨架成分主要包括：血影蛋白、肌動(dòng)蛋白、,錨蛋白,等。,（二）,細(xì)胞外被(cell coat)又叫糖萼。一般指動(dòng)物細(xì)胞外表由糖蛋白或糖脂構(gòu)成的絨絮狀物質(zhì)。起保護(hù)細(xì)胞和識(shí)別細(xì)胞的作用。,（三）胞外基質(zhì),是指分布于細(xì)胞外空間，由細(xì)胞分泌的蛋白和多糖所構(gòu)成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，它將細(xì)胞粘連在一起構(gòu)成組織，在細(xì)胞中或組織之間起支持作用。,細(xì)胞外基質(zhì)的基本成分是由,膠原蛋白和彈性蛋白,組成的,纖維蛋白、層粘連蛋白和纖粘連蛋白,組成的,粘連蛋白,和由,糖胺聚糖,形成的水合膠體構(gòu)成的復(fù)雜的結(jié)構(gòu)體系。層粘連蛋白和纖粘連蛋白具有多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，在細(xì)胞與胞外基質(zhì)成分相互粘著中起重要作用。,（四）基底膜：,膠原蛋白,1、膠原蛋白的類型及分子結(jié)構(gòu),膠原,蛋白,是胞外基質(zhì)最基本成分之一，是動(dòng)物體內(nèi)含量最豐富的蛋白，目前已發(fā)現(xiàn)20種。型膠原是形成纖維的膠原，型纖維為片狀(或網(wǎng)狀)結(jié)構(gòu)，基膜所特有。,膠原纖維的基本分子結(jié)構(gòu)是原膠原。原膠原由3條多肽連盤繞成3股螺旋結(jié)構(gòu)，長(zhǎng)300nm直徑1.5nm，具有Glyxy（甘氨酸-脯氨酸-羥脯氨酸）重復(fù)序列。,2、膠原,蛋白,的功能,膠原在細(xì)胞外基質(zhì)中含量最高，,剛性和抗張力強(qiáng)度最大,，構(gòu)成細(xì)胞外基質(zhì)的骨架結(jié)構(gòu)，對(duì)細(xì)胞具有粘連作用。,膠原基質(zhì)能影響培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化。,糖胺聚糖和蛋白聚糖,1、糖胺聚糖,糖胺聚糖由重復(fù)的氨基已糖+糖醛酸二糖單位構(gòu)成的長(zhǎng)鏈多糖?？煞譃?類。如透明質(zhì)酸、肝素等。,透明質(zhì)酸是一種重要的糖氨聚糖是細(xì)胞增殖和遷移細(xì)胞胞外基質(zhì)的主要成分，尤其在胚胎組織中。在胞外基質(zhì)中，透明質(zhì)酸使結(jié)締具有,抗壓能力,。,2、蛋白聚糖,蛋白聚糖是由糖胺聚糖與核心蛋白的絲氨酸殘基共價(jià)連接形成的分子，這樣的單體可借連接蛋白以非共價(jià)鍵與透明質(zhì)酸結(jié)合形成多聚體。,層粘連蛋白和纖粘連蛋白,這兩種蛋白均為高分子量糖蛋白。,1、層粘連蛋白,層粘連蛋白是動(dòng)物組織基膜的主要結(jié)構(gòu)組分，對(duì)基膜,基質(zhì)的組裝起關(guān)鍵作用，可介導(dǎo)細(xì)胞粘著于膠原進(jìn)而鋪展，,并促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)。,通常細(xì)胞不直接與型膠原或蛋白聚糖結(jié)合，而是通過(guò),層粘連蛋白將細(xì)胞錨定于基膜上。,2、纖粘連蛋,纖粘連蛋白的主要功能是介導(dǎo)細(xì)胞粘著。,彈性蛋白,彈性蛋白是彈性纖維的主要成分。,彈性纖維與膠原纖維共同存在，分別賦予組織以彈性及抗張性。,（五）、植物細(xì)胞壁,植物細(xì)胞壁可看作是高等植物細(xì)胞的胞外基質(zhì)，主要成分是纖維素、半纖維素、果膠質(zhì)、伸展蛋白和蛋白聚糖等。細(xì)胞壁不僅起支持保護(hù)作用，而且其中的某些寡糖具有信號(hào)分子的作用。,胞外基質(zhì)不僅提供細(xì)胞外的網(wǎng)架賦予組織以抗壓和抗張力的機(jī)械性能，而且還與細(xì)胞的增殖分化和凋亡等重要生命活動(dòng)有關(guān)。,第二節(jié) 細(xì)胞連接,細(xì)胞連接是多細(xì)胞有機(jī)體中相鄰細(xì)胞之間通過(guò)質(zhì)膜相互聯(lián)系、協(xié)同作用的重要結(jié)構(gòu)。主要有3種類型：,封閉連接、錨定連接、,通訊連接,一、封閉連接,封閉連接的主要形式是緊密連接,。,緊密連接存在于上皮細(xì)胞之間,，通過(guò)嵴線,使相鄰細(xì)胞質(zhì)膜緊靠在一起，可阻止可溶性物質(zhì)沿細(xì)胞間隙滲入體內(nèi)。,同時(shí)還起到膜蛋白的隔離作用。,二、錨定連接,錨定連接使相鄰細(xì)胞的骨架系統(tǒng)或?qū)⒓?xì)胞與基質(zhì)相連形成 一個(gè)堅(jiān)挺有序的群體。,（一）橋粒與半橋粒,橋粒在細(xì)胞之間形成紐扣式的結(jié)構(gòu)將相鄰細(xì)胞鉚接在一起，同時(shí)也是細(xì)胞內(nèi)中等纖維的錨定位點(diǎn),。橋粒相鄰細(xì)胞質(zhì)膜的間隙約30nm。在質(zhì)膜的胞質(zhì)面有一致密斑，中間纖維直接與其相連。相鄰兩細(xì)胞的致密斑由跨膜連接糖蛋白連接。,（二）粘合帶與粘合斑,粘合帶位于上皮組織的下方，相鄰細(xì)胞間形成一個(gè)連續(xù)的帶狀結(jié)構(gòu),。粘合帶處相鄰細(xì)胞質(zhì)膜的間隙約1520nm。與粘合帶相連的是,微絲（,又稱肌動(dòng)蛋白纖維），在細(xì)胞中形成平行質(zhì)膜的可收縮的纖維束。,粘合斑是肌動(dòng)蛋白纖維與細(xì)胞外基質(zhì)的連接方式。在粘合斑處，跨膜連接糖蛋白向外通過(guò)纖粘連蛋白與胞外,基質(zhì)結(jié)合，其胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域則通過(guò)微絲結(jié)合蛋白與肌動(dòng)蛋白纖維結(jié)合。,粘合帶及粘合斑均起細(xì)胞附著與支持作用,。,三、通訊連接,（一）間隙連接,間隙連接相鄰處質(zhì)膜間的間隙為23nm。連接的基本單位是連接子。連接子由6個(gè)相同或類似的跨膜蛋白亞單位環(huán)繞。形成直徑越1.5nm的孔道。相鄰細(xì)胞質(zhì)膜上的兩個(gè)連接子相對(duì)形成間隙連接單位。,間隙連接在細(xì)胞間代謝耦聯(lián)和細(xì)胞通訊中具有重要作用。,（二）胞間連絲,高等植物細(xì)胞之間通過(guò)胞間連絲相互連接，完成細(xì)胞通訊聯(lián)絡(luò)。,（三）化學(xué)突觸,化學(xué)突觸是存在于可興奮細(xì)胞之間的細(xì)胞連接方式，它通過(guò)釋放神經(jīng)遞質(zhì)來(lái)傳導(dǎo)神經(jīng)沖動(dòng)。,四、細(xì)胞表面的粘著因子（了解）,細(xì)胞與細(xì)胞之間的粘連是由特定的細(xì)胞粘著因子鈣粘素等介導(dǎo)的，細(xì)胞之間的錨定連接也需要粘著因子鈣粘素與整聯(lián)蛋白等參與。,粘著因子均為整合膜蛋白，在胞內(nèi)與細(xì)胞骨架成分相連。多數(shù)要依賴Ca,2+,或Mg,2+,才起作用，少數(shù)不需要Ca,2,。,1、鈣粘素,同親性依賴Ca,2+,的細(xì)胞粘連