《垂直板聚丙烯酰胺凝膠連續(xù)電泳分離乳酸脫氫酶同工酶》由會員分享，可在線閱讀，更多相關(guān)《垂直板聚丙烯酰胺凝膠連續(xù)電泳分離乳酸脫氫酶同工酶（18頁珍藏版）》請?jiān)谘b配圖網(wǎng)上搜索。

1、教學(xué)目的：,聚丙烯酰胺凝膠電泳分離乳酸脫氫酶同工酶,掌握聚丙烯酰胺凝膠電泳的基本原理； 掌握聚丙烯酰胺凝膠分離乳酸脫氫酶的操作技術(shù) 3. 掌握乳酸脫氫酶同工酶及酶活性染色。,聚丙烯酰胺凝膠電泳的基本原理； 連續(xù)體系和不連續(xù)體系。,重點(diǎn)難點(diǎn)：,LOGO,Your site here,實(shí)驗(yàn)原理,聚丙烯酰胺凝膠: 是由單體丙烯酰胺(Acr)和交聯(lián)劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺(Bis)在催化劑N，N，N，N四甲基乙二胺(TEMED)和過硫酸銨(AP)或核黃素的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)。 AP提供自由基，TEMED是催化劑，催化自由基引起的

2、聚合反應(yīng)進(jìn)行。 電泳 帶電顆粒在電場的作用下，向著與其電性相反的電極方向移動(dòng)，這種現(xiàn)象稱之為電泳。,3,AP-TMTED催化體系,TEMED催化AP生成硫酸自由基： S2O82 2SO4 硫酸自由基的氧原子激活A(yù)cr單體并形成單體長鏈： Bis將單體長鏈間連成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)：,,LOGO,Your site here,實(shí)驗(yàn)原理,（聚丙烯酰胺）,LOGO,Your site here,聚丙烯酰胺凝膠有下列特性：,1.凝膠透明，有彈性，機(jī)械性能好； 2.化學(xué)性能穩(wěn)定，與被分離物不起化學(xué)反應(yīng)； 3.對pH和溫度變化較穩(wěn)定,幾乎無吸附和電滲作用； 4.樣品用量少，靈敏度可達(dá)10-6g; 5.凝膠孔徑可

3、調(diào)節(jié)； 6.分辨率高。,6,凝膠的總質(zhì)量濃度T和交聯(lián)度C決定凝膠的有效孔徑。凝膠的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)具有分子篩效應(yīng)，不同大小和形狀的大分子通過孔徑時(shí)所受的阻滯力不同，加上大分子的電荷效應(yīng)，使各種大分子遷移率不同得以分離。 大多數(shù)蛋白質(zhì)在7.5%凝膠中能得到滿意的結(jié)果，所以這個(gè)濃度的凝膠稱為標(biāo)準(zhǔn)膠。 當(dāng)分析一個(gè)未知樣品時(shí)，常用標(biāo)準(zhǔn)膠或梯度凝膠來測試，而后確定適宜的凝膠濃度。,7,聚丙烯酰胺凝膠電泳的類型,連續(xù)系統(tǒng) 是指電泳系統(tǒng)采用相同孔徑的凝膠、緩沖系統(tǒng)等條件下進(jìn)行區(qū)帶電泳，是利用蛋白質(zhì)分子的電荷效應(yīng)進(jìn)行分離，凝膠的分子篩效應(yīng)不明顯，一般只用于分離一些比較簡單的樣品，缺點(diǎn)是分辨率不高。優(yōu)點(diǎn)是制膠簡單快

4、捷，緩沖系統(tǒng)的pH恒定，可以防止樣品進(jìn)膠后因pH變化發(fā)生凝聚和沉淀，緩沖系統(tǒng)組成簡單。,8,,不連續(xù)系統(tǒng) 是指使用不同孔徑的凝膠和不同緩沖體系的電泳方式，在電泳分離過程中，由于濃縮膠的堆積作用，可使樣品在濃縮膠和分離膠的界面上先濃縮成一窄帶，對樣品進(jìn)行濃縮，然后在一定濃度或濃度梯度的凝膠上進(jìn)行分離，既存在電荷效應(yīng)，也有分子篩效應(yīng)。雖然制膠操作難度較大，但是它具有連續(xù)系統(tǒng)不可比擬的優(yōu)越性，分辨率高。 不連續(xù)電泳的四個(gè)不連續(xù)性 凝膠濃度的不連續(xù)性；緩沖液離子成分的不連續(xù)性；緩沖液pH梯度的不連續(xù)性；電位梯度的不連續(xù)性。,9,蛋白質(zhì)在凈電荷聚丙烯酰胺凝膠電泳中的分離因素,電荷因素 蛋白質(zhì)分子形狀

5、和大小相同，所帶電荷性質(zhì)和數(shù)量不同 分子大小 蛋白質(zhì)分子形狀和所帶電荷性質(zhì)和數(shù)量相同，分子大小不同 分子形狀 蛋白質(zhì)分子所帶電荷性質(zhì)和數(shù)量相同，分子形狀不同,電荷因素 分子大小 分子形狀,10,關(guān)于乳酸脫氫酶,1959年Markert等用電泳的方法將純化的心肌乳酸脫氫酶(LDH)分離出5條區(qū)帶，由陽極到陰極依次命名為LDH1、LDH2、LDH3、LDH4、LDH5，它們均具有LDH催化活性，從而首先提出了同工酶的概念。目前已知LDH同工酶是由H和M亞基按不同比例組成的四聚體。 LDH同工酶廣泛存在于動(dòng)植物及微生物中，動(dòng)物各組織中LDH同工酶各組分含量不同。臨床上對LDH及同工酶的檢測可

6、作為某些疾病診斷的依據(jù)之一。,11,乳酸脫氫酶同工酶活性染色,用活性染色對LDH進(jìn)行鑒定，將凝膠浸泡在活性染色液中，LDH與底物的反應(yīng)，用甲硫吩嗪(PMS)作為電子的中間載體，氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT)作為最終電子受體，底物脫下的氫最后傳遞給NBT，NBT被還原后，產(chǎn)生藍(lán)紫色的不溶于水的物質(zhì)以對LDH定位。反應(yīng)式如下：,LOGO,Your site here,分離膠的制備,濃縮膠的制備,加樣,待分離樣品的準(zhǔn)備,電泳 （電壓100-120v，電流20mA）,,,染色 電泳結(jié)束后，撬開玻璃板，將凝膠板做好標(biāo)記后放在大培養(yǎng)皿內(nèi)，加入染色液，染色30min；,,LOGO,Your site here,

7、分離膠的制備,置小燒杯中,混勻,迅速注入到二塊玻璃板之間(短玻璃朝負(fù)極),凝膠加至橫板的0.5cm處； 在室溫中聚合20-30分鐘。 注意：acr/bis有神經(jīng)毒/制膠時(shí)避免產(chǎn)生氣泡,14,,1. 晶狀體 40L 2. 腦 40L 3. 心臟 40L 4. 肝臟 40L 5. 腎臟 40L 6. 卵巢 40L 7. 肌肉 40L,注意：加樣前先倒入電泳緩沖液，沒過短玻璃；上樣時(shí)不要扎破加樣孔，也要避免樣品溢出。,15,,電泳結(jié)果實(shí)例,三. 實(shí)驗(yàn)報(bào)告的格式及要求：,原理（不連續(xù)體系電泳分離，活性染色） 操作（簡練陳述實(shí)際操作） 結(jié)果（鉛筆繪圖：正負(fù)極、條帶數(shù)目、強(qiáng)弱、距離，某組織） 結(jié)果說明（同工酶的組織特異性）,四. 思考題,1. 何謂連續(xù)體系？不連續(xù)體系？不連續(xù)體系的濃縮效應(yīng)是怎樣實(shí)現(xiàn)的？ 2. 操作中有哪些關(guān)鍵環(huán)節(jié)？應(yīng)做何處理？ 3. 用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)和分離乳酸脫氫酶同工酶有哪些相同之處和不同之處？,18,其他注意事項(xiàng),愛惜電泳裝置，輕拿輕放，避免產(chǎn)生劃痕，損壞需賠償！ 染色液價(jià)格昂貴，按量發(fā)放（兩塊膠30mL），隨用隨取，注意避光，如果沒有變綠仍可繼續(xù)使用，不影響染色效果！ 實(shí)驗(yàn)完成后，將電泳裝置洗凈，所用配件放回盤中，老師檢查合格后方可離開！,