《蛋白質(zhì)組學(xué)proteomicswxj課件》由會(huì)員分享，可在線閱讀，更多相關(guān)《蛋白質(zhì)組學(xué)proteomicswxj課件（100頁珍藏版）》請(qǐng)?jiān)谘b配圖網(wǎng)上搜索。

1、蛋白質(zhì)組學(xué)proteomicswxj課件ProteomicsProteomics 蛋白質(zhì)組學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)博學(xué)至精博學(xué)至精 明德至善明德至善蛋白質(zhì)組學(xué)proteomicswxj課件Proteome&Proteomics 定義定義nProteome：n1994年，由澳大利亞年，由澳大利亞Macguarie大學(xué)的大學(xué)的Wilkins等等首先提出：首先提出：“蛋白質(zhì)組指由一個(gè)細(xì)胞或一個(gè)組織蛋白質(zhì)組指由一個(gè)細(xì)胞或一個(gè)組織的基因組所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)的基因組所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)”n“proteome”是由蛋白質(zhì)一詞的前幾個(gè)字母是由蛋白質(zhì)一詞的前幾個(gè)字母“prote”和基因組一詞的后幾個(gè)字母和基因組一詞的后幾個(gè)字

2、母“ome”拼接拼接而成而成博學(xué)至精博學(xué)至精 明德至善明德至善蛋白質(zhì)組學(xué)proteomicswxj課件Proteome&Proteomics 定義定義nProteomics：n蛋白質(zhì)組學(xué)是從整體水平細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)組學(xué)是從整體水平細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的組成組成、結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)、功能功能及其及其動(dòng)態(tài)變化規(guī)律動(dòng)態(tài)變化規(guī)律的科學(xué)。的科學(xué)。n研究?jī)?nèi)容包括分析蛋白質(zhì)組所有組分及它們的表研究?jī)?nèi)容包括分析蛋白質(zhì)組所有組分及它們的表達(dá)水平，確定各種組分的空間定位、修飾方法、達(dá)水平，確定各種組分的空間定位、修飾方法、互作機(jī)制、生物活性及相應(yīng)特定功能等。互作機(jī)制、生物活性及相應(yīng)特定功能等。n由此獲得蛋白質(zhì)水平上的關(guān)于疾病發(fā)

3、生，細(xì)胞代由此獲得蛋白質(zhì)水平上的關(guān)于疾病發(fā)生，細(xì)胞代謝等過程的整體而全面的認(rèn)識(shí)謝等過程的整體而全面的認(rèn)識(shí) 博學(xué)至精博學(xué)至精 明德至善明德至善蛋白質(zhì)組學(xué)proteomicswxj課件Genome&Proteome博學(xué)至精博學(xué)至精 明德至善明德至善蛋白質(zhì)組學(xué)proteomicswxj課件Genomics Transcriptomics&Proteomics博學(xué)至精博學(xué)至精 明德至善明德至善蛋白質(zhì)組學(xué)proteomicswxj課件Proteomics&Structural Genomics博學(xué)至精博學(xué)至精 明德至善明德至善蛋白質(zhì)組學(xué)proteomicswxj課件Proteomics&Function

4、al Genomics博學(xué)至精博學(xué)至精 明德至善明德至善蛋白質(zhì)組學(xué)proteomicswxj課件特點(diǎn)之一 整體性博學(xué)至精博學(xué)至精 明德至善明德至善蛋白質(zhì)組學(xué)proteomicswxj課件特點(diǎn)之二 系統(tǒng)性博學(xué)至精博學(xué)至精 明德至善明德至善蛋白質(zhì)組學(xué)proteomicswxj課件特點(diǎn)之三 動(dòng)態(tài)性博學(xué)至精博學(xué)至精 明德至善明德至善蛋白質(zhì)組學(xué)proteomicswxj課件nStructural Proteomics n結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)nFunctional Proteomics n功能蛋白質(zhì)組學(xué)功能蛋白質(zhì)組學(xué) 分類博學(xué)至精博學(xué)至精 明德至善明德至善蛋白質(zhì)組學(xué)proteomicswxj課件S

5、tructural ProteomicsnSeparationnIdentificationnPTM(post-translational modification)IdentificationnComparison&Subtraction Analysis 博學(xué)至精博學(xué)至精 明德至善明德至善蛋白質(zhì)組學(xué)proteomicswxj課件Functional Proteomics nLocalizationnProtein Complex DeterminationnProtein-Protein Interaction/Interaction NetworknFunction of Protein

6、(Metabolic and Regulatory Pathway;Signal Transduction Pathway)博學(xué)至精博學(xué)至精 明德至善明德至善蛋白質(zhì)組學(xué)proteomicswxj課件n 蛋白質(zhì)鑒定：可以利用一維電泳和二維電泳并結(jié)合生物質(zhì)譜、Western印跡、蛋白質(zhì)芯片等技術(shù)，對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行全面的鑒定研究。n 翻譯后修飾的鑒定：如磷酸化、糖基化、酶原激活等過程。n 蛋白質(zhì)功能確定：包括蛋白質(zhì)定位研究，蛋白質(zhì)活性，蛋白質(zhì)相互作用，酶活性和確定酶底物，細(xì)胞因子的生物分析，配基-受體結(jié)合分析等。蛋白質(zhì)組學(xué)的主要任務(wù)蛋白質(zhì)組學(xué)proteomicswxj課件蛋白質(zhì)組學(xué)研究思路與方法蛋白質(zhì)組

7、學(xué)研究思路與方法策略、技術(shù)、工具策略、技術(shù)、工具博學(xué)至精博學(xué)至精 明德至善明德至善蛋白質(zhì)組學(xué)proteomicswxj課件主要專業(yè)術(shù)語及其英文對(duì)照和縮寫主要專業(yè)術(shù)語及其英文對(duì)照和縮寫nIPG-IEF：固相固相pH梯度等電聚焦（梯度等電聚焦（immobilized pH gradients isoelectric focusing）nSDS-PAGE：十二烷基硫酸鈉十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電聚丙烯酰胺凝膠電泳（泳（Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis）n2-DE：雙向電泳雙向電泳(Two Dimensional

8、Electrophoresis)nHPLC：高效液相色譜高效液相色譜（High performance Liquid Chromatography）nMALDI-TOF MS：基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)：基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（間質(zhì)譜（Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry)博學(xué)至精博學(xué)至精 明德至善明德至善蛋白質(zhì)組學(xué)proteomicswxj課件n蛋白序列數(shù)據(jù)庫（SWISS-PROT/TrEMBL；http:/）n基因序列數(shù)據(jù)庫（Genbank，http:/EMBL；h

9、ttp:/）n蛋白模式數(shù)據(jù)庫（Prosite；http:/）n蛋白質(zhì)二維凝膠電泳數(shù)據(jù)庫、蛋白三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫（PDB，http:/；FSSP，）n蛋白翻譯后修飾數(shù)據(jù)庫（O-GLYCBASE，http:/databases/OGLYCBASE）蛋白質(zhì)組學(xué)研究相關(guān)數(shù)據(jù)庫蛋白質(zhì)組學(xué)研究相關(guān)數(shù)據(jù)庫博學(xué)至精博學(xué)至精 明德至善明德至善蛋白質(zhì)組學(xué)proteomicswxj課件研究策略研究策略n兩條互補(bǔ)的實(shí)驗(yàn)流程兩條互補(bǔ)的實(shí)驗(yàn)流程n基于凝膠的工作流程基于凝膠的工作流程（Gel-based workflow）n基于液相色譜的工作流程基于液相色譜的工作流程（LC-based workflow）博學(xué)至精博學(xué)至精 明德

10、至善明德至善蛋白質(zhì)組學(xué)proteomicswxj課件Classical GE&LC to Protein ID Gapelo(2010)J ProteomicsHPLC-MS博學(xué)至精博學(xué)至精 明德至善明德至善蛋白質(zhì)組學(xué)proteomicswxj課件博學(xué)至精博學(xué)至精 明德至善明德至善蛋白質(zhì)組學(xué)proteomicswxj課件v雙向電泳（two dimensional gel electrophoresis,2D-GE）v差示電泳（differential gel electrophoresis,DIGE）v毛細(xì)管電泳 (capillary electrophoresis,CE)v高效液相色譜(hi

11、gh performance liquid chromatography,HPLC)分子篩柱層析分子篩柱層析 反向柱層析反向柱層析v質(zhì)譜分析(mass spectrometry MS)基質(zhì)基質(zhì)輔助激光解吸離子化輔助激光解吸離子化-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜(matrix-assisted laser disorption ionization-time of flight/tandem MS,MALDI-TOF/MS/MS)電噴霧離子化電噴霧離子化串聯(lián)質(zhì)譜串聯(lián)質(zhì)譜（electrospray ionization ESI-MS）v生物信息學(xué)博學(xué)至精博學(xué)至精 明德至善明德至善蛋白質(zhì)組學(xué)pro

12、teomicswxj課件蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)室所需的條件蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)室所需的條件博學(xué)至精博學(xué)至精 明德至善明德至善蛋白質(zhì)組學(xué)proteomicswxj課件蛋白質(zhì)組學(xué)研究的基本技術(shù)路線蛋白質(zhì)組學(xué)研究的基本技術(shù)路線蛋白質(zhì)樣品的制備蛋白質(zhì)樣品的制備雙向電泳或雙向電泳或HPLC圖像分析圖像分析凝膠中的蛋白凝膠中的蛋白溶液中的蛋白溶液中的蛋白混合肽混合肽蛋白質(zhì)質(zhì)量蛋白質(zhì)質(zhì)量N端測(cè)序端測(cè)序肽序列質(zhì)譜數(shù)據(jù)肽序列質(zhì)譜數(shù)據(jù)肽指紋圖肽指紋圖數(shù)據(jù)搜索數(shù)據(jù)搜索新的或已知蛋白新的或已知蛋白翻譯后修飾的鑒定翻譯后修飾的鑒定酶解酶解博學(xué)至精博學(xué)至精 明德至善明德至善蛋白質(zhì)組學(xué)proteomicswxj課件Sample Prot

13、ein PreparationUsually the complexity of the protein and/or peptide mixture lies beyond the theoretical separation space of any separation method.Proteome Complexity.Genomic transcription in diversity;post-transcription processing;post-translational modification;constitution of combinatorial complex

14、.It requires quite a long time for analysis of protein complex.Sample recovery low through separation:more steps,less overall recovery.The conc.of the proteins with a range of 6-order magnitude:in tissues,protein concentrations span a dynamic range of six orders of magnitudes(for regulatory protein

15、or TFs a few molecules per cell,for housekeeping proteins million copies per cell).So,it is difficult to detect very low concentrated proteins in the presence of highly abundant proteins.The complex protein samples with limited stability due to existence of enzymes and proteases,enzyme inhibitors ca

16、n only partly stabilize the sample.博學(xué)至精博學(xué)至精 明德至善明德至善蛋白質(zhì)組學(xué)proteomicswxj課件Many parameters influence the composition of proteome between induced and inherent biological variations,such as genetic differences,gender and age of patients and cell growth conditions.This requires sample replicates.(statisti

17、cians would demand at least five replicates,in many cases three replicates can deliver highly confident results.In clinical the number of required proteins are much high).Membrane proteins are very difficult to solubilize,and easy to loss during sample preparation and separation by sticking to a sur

18、face or aggregation.Post-translational modifications(PTMs)like phosphorylation and glycosylation require sophisticated analysis tools like MSn,where the peptide ions generated several times fragmented.Sample Protein Preparation博學(xué)至精博學(xué)至精 明德至善明德至善蛋白質(zhì)組學(xué)proteomicswxj課件蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)-樣品預(yù)分離樣品預(yù)分離n樣品

19、的制備（預(yù)處理）樣品的制備（預(yù)處理）：n組織組織n細(xì)胞細(xì)胞n細(xì)胞器（線粒體、葉綠體、細(xì)胞核）細(xì)胞器（線粒體、葉綠體、細(xì)胞核）博學(xué)至精博學(xué)至精 明德至善明德至善蛋白質(zhì)組學(xué)proteomicswxj課件蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)-蛋白提取蛋白提取n重要性：重要性：n在制備時(shí)丟失的蛋白永遠(yuǎn)不能在后面實(shí)驗(yàn)中彌補(bǔ)在制備時(shí)丟失的蛋白永遠(yuǎn)不能在后面實(shí)驗(yàn)中彌補(bǔ)n原則：原則：n使所有待分析的蛋白樣品全部處于溶解狀態(tài)使所有待分析的蛋白樣品全部處于溶解狀態(tài) n防止樣品在聚焦時(shí)發(fā)生蛋白的聚集和沉淀防止樣品在聚焦時(shí)發(fā)生蛋白的聚集和沉淀 n防止在樣品制備過程中發(fā)生樣品的抽提后化學(xué)修防止在樣品制備過程中發(fā)

20、生樣品的抽提后化學(xué)修飾（如酶性或化學(xué)性降解等）飾（如酶性或化學(xué)性降解等）n完全去除樣品中的核酸和某些干擾蛋白完全去除樣品中的核酸和某些干擾蛋白 博學(xué)至精博學(xué)至精 明德至善明德至善蛋白質(zhì)組學(xué)proteomicswxj課件蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)-蛋白提取蛋白提取n步驟：步驟：n破碎破碎n沉淀蛋白沉淀蛋白n去除雜質(zhì)去除雜質(zhì)博學(xué)至精博學(xué)至精 明德至善明德至善蛋白質(zhì)組學(xué)proteomicswxj課件蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)-蛋白提取蛋白提取n樣品制備流程樣品制備流程-破碎破碎盡可能減少蛋白水解盡可能減少蛋白水解/其它形式蛋白降解原則其它形式蛋白降解原則n機(jī)械法（

21、超聲波法、高壓法機(jī)械法（超聲波法、高壓法、機(jī)械勻漿法、機(jī)械勻漿法）n化學(xué)法（去污劑法、酶裂解法化學(xué)法（去污劑法、酶裂解法）n物理法（液氮研磨法、反復(fù)凍融法、滲透物理法（液氮研磨法、反復(fù)凍融法、滲透法法、玻璃珠破碎法、玻璃珠破碎法）博學(xué)至精博學(xué)至精 明德至善明德至善蛋白質(zhì)組學(xué)proteomicswxj課件蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)-蛋白提取蛋白提取n樣品制備流程樣品制備流程-沉淀蛋白沉淀蛋白 去雜濃縮后蛋白可溶性是關(guān)鍵去雜濃縮后蛋白可溶性是關(guān)鍵 n三氯醋酸（三氯醋酸（TCA）-丙酮沉淀法丙酮沉淀法 nTCA沉淀法沉淀法 引起降解引起降解/修飾修飾 n丙酮沉淀法丙酮沉淀法 n硫酸

22、銨沉淀法硫酸銨沉淀法 影響影響IEFn醋酸銨沉淀法醋酸銨沉淀法 步驟繁瑣步驟繁瑣 博學(xué)至精博學(xué)至精 明德至善明德至善蛋白質(zhì)組學(xué)proteomicswxj課件2D電泳結(jié)果影響因素分析電泳結(jié)果影響因素分析博學(xué)至精博學(xué)至精 明德至善明德至善蛋白質(zhì)組學(xué)proteomicswxj課件蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)-蛋白提取蛋白提取n樣品制備流程樣品制備流程-去除雜質(zhì)去除雜質(zhì) 關(guān)鍵是盡量不丟失蛋白和減少蛋白修飾關(guān)鍵是盡量不丟失蛋白和減少蛋白修飾 n核酸的清除核酸的清除（DNase/RNase）n多糖的清除多糖的清除（超離心（超離心、TCA沉淀等）沉淀等）n去污劑的清除去污劑的清除（丙酮沉淀法

23、等）（丙酮沉淀法等）n鹽離子和外源帶電小分子的清除（透析、鹽離子和外源帶電小分子的清除（透析、TCA-丙酮沉淀法）丙酮沉淀法）博學(xué)至精博學(xué)至精 明德至善明德至善蛋白質(zhì)組學(xué)proteomicswxj課件2D電泳結(jié)果影響因素分析電泳結(jié)果影響因素分析可能原因：樣品含高豐度可能原因：樣品含高豐度Pr可能原因：可能原因：TCA殘留致使殘留致使Pr丟失丟失博學(xué)至精博學(xué)至精 明德至善明德至善蛋白質(zhì)組學(xué)proteomicswxj課件蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)-蛋白提取蛋白提取n樣品制備注意事項(xiàng)：樣品制備注意事項(xiàng)：n蛋白質(zhì)水解蛋白質(zhì)水解-蛋白酶抑制劑蛋白酶抑制劑(PMSF等等)n特殊樣品的制備

24、特殊樣品的制備(低豐度低豐度、強(qiáng)堿性蛋白質(zhì)、強(qiáng)堿性蛋白質(zhì)（核糖體）、極端分子量（核糖體）、極端分子量)n樣品定量樣品定量 n重復(fù)性重復(fù)性博學(xué)至精博學(xué)至精 明德至善明德至善蛋白質(zhì)組學(xué)proteomicswxj課件nTwo Dimensional Gel Electrophoresis(2D-GE)nDifferential Gel Electrophoresis(DIGE)Gel Electrophoresis博學(xué)至精博學(xué)至精 明德至善明德至善蛋白質(zhì)組學(xué)proteomicswxj課件Workflow for Two-Dimensional Electrophoresis(2-DE)GE(2004

25、)2-D Electrophoresis 博學(xué)至精博學(xué)至精 明德至善明德至善蛋白質(zhì)組學(xué)proteomicswxj課件two dimensional gel electrophoresis(2D-GE)博學(xué)至精博學(xué)至精 明德至善明德至善蛋白質(zhì)組學(xué)proteomicswxj課件Isoelectric Focusing Electrophoresis(IEF)IEF mainly applied for the following purposes:n1st dimensional fractionation of protein mixtures in high-resolution 2-D el

26、ectrophoresis nPre-fractionation of protein mixtures according to chargenFor the separation of very heterogeneous mixtures of tryptic peptides instead of strong cation exchange chromatography in MDLC-MSIPG immobilized pH gradientIPG Strip for IEFpH10.0 Cathode(-)pH 3.0Anode(+)pH103博學(xué)至精博學(xué)至精 明德至善明德至善蛋

27、白質(zhì)組學(xué)proteomicswxj課件IEF is performed in a pH gradient gel.Proteins Charged with Anion(-)or Cation(+)depend on(i)their molecular traits due to their acidic and basic groups,and(ii)the environmental pH.Environmental pH:in basic buffer,the acidic groups of proteins with negative charge;in acidic buffer,

28、the basic groups with positive charge.Protein Isoelectric Point(pI):At a pH value,the net charge of a protein is zero.39IEF Theoretical Background 博學(xué)至精博學(xué)至精 明德至善明德至善蛋白質(zhì)組學(xué)proteomicswxj課件40The Principle of Isoelectric Focusing Electrophoresis博學(xué)至精博學(xué)至精 明德至善明德至善蛋白質(zhì)組學(xué)proteomicswxj課件IEF PrincipleAmpholytes

29、to Create A pH Gradient:A Heterogeneous Mixture of Isomers of aliphatic oligoamino-oligocarboxylic acids under electricity field could align themselves due to individual molecule trait&create a pH gradient along cathode with high-pH to anode with low-pH.Ampholyte Properties:(i)high buffering and sol

30、ubility in its pI(ii)good and regular electric conductivity at its pI(iii)absence of biological effect(iv)low molecular weightThe Ampholyte-Gel:the ampholyte 2%(w/v),the gel 4%(T)&3%(C)Immobile pH Gradient Strip for Proteins Separation(IPG):(i)proteins applied to a position on the IPG strip could be

31、 charged with anion,cation and zero(ii)protein-cation moves forward cathode and stop the site where the pH value is equal to the pI of protein-cation;similarity for protein-anion to move forward anode and stop;protein-zero to be naive to move.41博學(xué)至精博學(xué)至精 明德至善明德至善蛋白質(zhì)組學(xué)proteomicswxj課件42Immobilized pH G

32、radient PolyacrylamideThe General Structure of Immobiline(Ampholyte)博學(xué)至精博學(xué)至精 明德至善明德至善蛋白質(zhì)組學(xué)proteomicswxj課件博學(xué)至精博學(xué)至精 明德至善明德至善蛋白質(zhì)組學(xué)proteomicswxj課件雙向凝膠電泳（雙向凝膠電泳（2-DE）n是是等電聚焦電泳等電聚焦電泳和和SDS-PAGE的組合的組合n即先進(jìn)行等電聚焦電泳（按照即先進(jìn)行等電聚焦電泳（按照pI分離）分離）n然后再進(jìn)行然后再進(jìn)行SDS-PAGE（按照分子大小）（按照分子大?。﹏凝膠經(jīng)染色得到二維分布的蛋白質(zhì)圖凝膠經(jīng)染色得到二維分布的蛋白質(zhì)圖 博學(xué)至精

33、博學(xué)至精 明德至善明德至善蛋白質(zhì)組學(xué)proteomicswxj課件蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)n2D-SDS-PAGE：n樣品制備樣品制備n第一向第一向IPG-IEF電泳電泳nIPG平衡平衡n第二向第二向SDS-PAGE電泳電泳n染色（銀染）及染色（銀染）及 圖譜分析圖譜分析n目標(biāo)蛋白獲取及其鑒定（目標(biāo)蛋白獲取及其鑒定（MC分析）分析）博學(xué)至精博學(xué)至精 明德至善明德至善蛋白質(zhì)組學(xué)proteomicswxj課件博學(xué)至精博學(xué)至精 明德至善明德至善蛋白質(zhì)組學(xué)proteomicswxj課件2-DEn第一向第一向IPG-IEF電泳nIEF是一種根據(jù)樣品的是一種根據(jù)樣品的等電點(diǎn)不同等電點(diǎn)不

34、同而使它而使它們?cè)趥冊(cè)趐H梯度中相互分離的一種電泳技術(shù)梯度中相互分離的一種電泳技術(shù)n將等電點(diǎn)不同的蛋白質(zhì)混合物加入有將等電點(diǎn)不同的蛋白質(zhì)混合物加入有pH梯梯度的凝膠介質(zhì)中，在電場(chǎng)內(nèi)經(jīng)過一定時(shí)間度的凝膠介質(zhì)中，在電場(chǎng)內(nèi)經(jīng)過一定時(shí)間后，各組分將分別聚焦在各自等電點(diǎn)相應(yīng)后，各組分將分別聚焦在各自等電點(diǎn)相應(yīng)的的pH位置上，形成分離的蛋白質(zhì)區(qū)帶位置上，形成分離的蛋白質(zhì)區(qū)帶n從而得知其等電點(diǎn)信息從而得知其等電點(diǎn)信息博學(xué)至精博學(xué)至精 明德至善明德至善蛋白質(zhì)組學(xué)proteomicswxj課件IPG-IEF電泳電泳博學(xué)至精博學(xué)至精 明德至善明德至善蛋白質(zhì)組學(xué)proteomicswxj課件2-DEn第二向垂直第二

35、向垂直SDS-PAGE電泳電泳n聚丙烯酰胺凝膠形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具有濃縮聚丙烯酰胺凝膠形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具有濃縮效應(yīng)、電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)效應(yīng)、電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)。SDS與蛋與蛋白質(zhì)形成雪茄狀帶負(fù)電荷復(fù)合物，從而消白質(zhì)形成雪茄狀帶負(fù)電荷復(fù)合物，從而消除了蛋白間的電荷及形狀差異，除了蛋白間的電荷及形狀差異，電泳速度電泳速度僅與分子量有關(guān)僅與分子量有關(guān) n從而得知其分子量信息從而得知其分子量信息博學(xué)至精博學(xué)至精 明德至善明德至善蛋白質(zhì)組學(xué)proteomicswxj課件第二向垂直第二向垂直SDS-PAGE電泳電泳n凝膠濃度與其對(duì)應(yīng)的分離范圍凝膠濃度與其對(duì)應(yīng)的分離范圍膠濃度膠濃度 分離范圍分離范圍(KD)5

36、%36-200 7.5%24-200 10%14-200 12.5%14-100 15%14-60博學(xué)至精博學(xué)至精 明德至善明德至善蛋白質(zhì)組學(xué)proteomicswxj課件第二向垂直第二向垂直SDS-PAGE電泳電泳Ettan Dalt twelve電泳系統(tǒng)電泳系統(tǒng)博學(xué)至精博學(xué)至精 明德至善明德至善蛋白質(zhì)組學(xué)proteomicswxj課件第二向垂直第二向垂直SDS-PAGE電泳電泳Ettan Dalt six電泳系統(tǒng)電泳系統(tǒng)博學(xué)至精博學(xué)至精 明德至善明德至善蛋白質(zhì)組學(xué)proteomicswxj課件2-DE 凝膠蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的檢測(cè)凝膠蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的檢測(cè)n染色：染色：1）考馬斯亮蘭染色法；）考馬斯亮蘭

37、染色法；2）銀染法；）銀染法；3）負(fù)染法；）負(fù)染法；4）熒光染色法；）熒光染色法；5）放射性同位素標(biāo)記法等）放射性同位素標(biāo)記法等博學(xué)至精博學(xué)至精 明德至善明德至善蛋白質(zhì)組學(xué)proteomicswxj課件n安全（安全（safety）n靈敏（靈敏（sensitivity）n簡(jiǎn)單（簡(jiǎn)單（simplicity）n特異性（特異性（specificity）n快速（快速（speed）n穩(wěn)定（穩(wěn)定（stability）n兼容性（兼容性（synergy）理想顯色劑的7S博學(xué)至精博學(xué)至精 明德至善明德至善蛋白質(zhì)組學(xué)proteomicswxj課件有機(jī)染料和銀染n考馬斯亮藍(lán)考馬斯亮藍(lán)染色靈敏度為染色靈敏度為30100

38、ng30100ng，線性范圍是，線性范圍是2020倍；倍；硝酸銀染色硝酸銀染色的線性范圍是的線性范圍是4040倍，靈敏度是考染的倍，靈敏度是考染的100100倍。倍。n膠體考馬斯亮藍(lán)膠體考馬斯亮藍(lán)染色技術(shù)可實(shí)現(xiàn)染色技術(shù)可實(shí)現(xiàn)PAGEPAGE的無背景染色，其的無背景染色，其極限靈敏度為極限靈敏度為810ng810ng，但這種染液會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾，但這種染液會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾而影響質(zhì)譜分析的結(jié)果。而影響質(zhì)譜分析的結(jié)果。n氨基黑氨基黑常用于轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯（常用于轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯（PVDFPVDF）和）和/或硝酸或硝酸纖維素膜上的蛋白質(zhì)的染色。纖維素膜上的蛋白質(zhì)的染色。n銀染的缺點(diǎn)是：對(duì)某些種

39、類的蛋白質(zhì)染色效果差，對(duì)其銀染的缺點(diǎn)是：對(duì)某些種類的蛋白質(zhì)染色效果差，對(duì)其后的蛋白質(zhì)測(cè)序和質(zhì)譜分析造成影響。后的蛋白質(zhì)測(cè)序和質(zhì)譜分析造成影響。n這兩類染色技術(shù)都可減少膠內(nèi)蛋白質(zhì)產(chǎn)量這兩類染色技術(shù)都可減少膠內(nèi)蛋白質(zhì)產(chǎn)量。博學(xué)至精博學(xué)至精 明德至善明德至善蛋白質(zhì)組學(xué)proteomicswxj課件 博學(xué)至精博學(xué)至精 明德至善明德至善蛋白質(zhì)組學(xué)proteomicswxj課件負(fù) 染n能專門能專門提高提高PAGE膠上蛋白質(zhì)的回收率膠上蛋白質(zhì)的回收率，但不能用，但不能用于膜上染色。于膜上染色。n結(jié)果表現(xiàn)為結(jié)果表現(xiàn)為膠面著色而蛋白質(zhì)點(diǎn)透明膠面著色而蛋白質(zhì)點(diǎn)透明。n速度快（速度快（515min），蛋白質(zhì)的生物活

40、性能保持：），蛋白質(zhì)的生物活性能保持：一旦用絡(luò)合劑如一旦用絡(luò)合劑如EDTA或或Tris/甘氨酸轉(zhuǎn)移緩沖液來甘氨酸轉(zhuǎn)移緩沖液來絡(luò)合金屬離子就可進(jìn)行提取來轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)。絡(luò)合金屬離子就可進(jìn)行提取來轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)。n它主要適用于蛋白質(zhì)顯色、完整蛋白質(zhì)的膠上被它主要適用于蛋白質(zhì)顯色、完整蛋白質(zhì)的膠上被動(dòng)提取以及質(zhì)譜分析。動(dòng)提取以及質(zhì)譜分析。n該技術(shù)主要包括金屬鹽染料、鋅咪唑染料等的該技術(shù)主要包括金屬鹽染料、鋅咪唑染料等的使用。使用。博學(xué)至精博學(xué)至精 明德至善明德至善蛋白質(zhì)組學(xué)proteomicswxj課件膠體擴(kuò)散染料n主要用于主要用于高靈敏度檢出電轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素高靈敏度檢出電轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素和和PVDF膜上

41、的蛋白質(zhì)膜上的蛋白質(zhì)，不用于膠內(nèi)染色。，不用于膠內(nèi)染色。n最好的膠體金染色的靈敏度與最好的膠體金染色的靈敏度與PAGE膠內(nèi)的膠內(nèi)的銀染類似。銀染類似。n這種技術(shù)主要包括這種技術(shù)主要包括麗春紅、印度墨水染料、麗春紅、印度墨水染料、膠體金染料膠體金染料等。等。博學(xué)至精博學(xué)至精 明德至善明德至善蛋白質(zhì)組學(xué)proteomicswxj課件有機(jī)熒光團(tuán)染料n包括共價(jià)結(jié)合和非共價(jià)結(jié)合的熒光團(tuán)染料兩類。后者最為包括共價(jià)結(jié)合和非共價(jià)結(jié)合的熒光團(tuán)染料兩類。后者最為常用，其典型代表是已經(jīng)商品化的常用，其典型代表是已經(jīng)商品化的SYPRO Red、Orange、Ruby等熒光染料。等熒光染料。n這三種染料可對(duì)這三種染料可

42、對(duì)SDS-PAGE膠內(nèi)蛋白質(zhì)進(jìn)行一步染色，約膠內(nèi)蛋白質(zhì)進(jìn)行一步染色，約3060min完成，靈敏度為完成，靈敏度為210ng。染色后的凝膠用標(biāo)準(zhǔn)的。染色后的凝膠用標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)室300nm紫外透射儀進(jìn)行照像保存，其線性范圍為紫外透射儀進(jìn)行照像保存，其線性范圍為3個(gè)個(gè)數(shù)量級(jí)。數(shù)量級(jí)。n這三種染料的電泳染色結(jié)果與在酵母中通過這三種染料的電泳染色結(jié)果與在酵母中通過SAGE所獲得所獲得的基因表達(dá)水平的動(dòng)態(tài)范圍相匹配。的基因表達(dá)水平的動(dòng)態(tài)范圍相匹配。n在在Tris/甘氨酸轉(zhuǎn)印緩沖液中染色后，蛋白質(zhì)可被轉(zhuǎn)印至膜甘氨酸轉(zhuǎn)印緩沖液中染色后，蛋白質(zhì)可被轉(zhuǎn)印至膜上并進(jìn)行免疫染色或上并進(jìn)行免疫染色或Edman測(cè)序來

43、鑒定蛋白質(zhì)。測(cè)序來鑒定蛋白質(zhì)。博學(xué)至精博學(xué)至精 明德至善明德至善蛋白質(zhì)組學(xué)proteomicswxj課件博學(xué)至精博學(xué)至精 明德至善明德至善蛋白質(zhì)組學(xué)proteomicswxj課件金屬螯合染料n這是一類與現(xiàn)代蛋白質(zhì)組學(xué)研究相兼容的、這是一類與現(xiàn)代蛋白質(zhì)組學(xué)研究相兼容的、相對(duì)較新的蛋白質(zhì)顯色試劑，其設(shè)計(jì)專門與相對(duì)較新的蛋白質(zhì)顯色試劑，其設(shè)計(jì)專門與常用微量化學(xué)表征過程兼容。它們不包含戊常用微量化學(xué)表征過程兼容。它們不包含戊二醛、甲醛或二醛、甲醛或Tween-20等，很容易和集成化等，很容易和集成化蛋白質(zhì)組學(xué)平臺(tái)（包括自動(dòng)化凝膠染色儀、蛋白質(zhì)組學(xué)平臺(tái)（包括自動(dòng)化凝膠染色儀、圖像分析工作站、機(jī)器人剪切儀

44、器、蛋白質(zhì)圖像分析工作站、機(jī)器人剪切儀器、蛋白質(zhì)酶解工作站和質(zhì)譜儀等）相結(jié)合。酶解工作站和質(zhì)譜儀等）相結(jié)合。n其中其中SYPRO Ruby也是一種基于釕的金屬發(fā)也是一種基于釕的金屬發(fā)光染料。光染料。博學(xué)至精博學(xué)至精 明德至善明德至善蛋白質(zhì)組學(xué)proteomicswxj課件 靈敏度 20pg博學(xué)至精博學(xué)至精 明德至善明德至善蛋白質(zhì)組學(xué)proteomicswxj課件2DE重復(fù)性重復(fù)性The same protocol and sample,however not the same resultsRec:similar;cir:different 博學(xué)至精博學(xué)至精 明德至善明德至善蛋白質(zhì)組學(xué)prot

45、eomicswxj課件DIGE&Proteins Labeled with CyDyesProteins labeled with CyDyes:with dyes cyanine(Cy2 blue,Cy3 red,Cy5 green),the dyes cannot influence protein property as well as its molecular weight much.The Mixed Run on 2-DE:the mixed ratio at 1:1,run on the same 2-DE,the same kind of proteins with diff

46、erent dyes from different samples can co-migrate.The Mixed Gel Scanned:with laser scanner to scan the mixed ran gel at different wavelengths according to CyDyeThe Result Read out:the position and the color of the protein spots on DIGE image,the position to represent the protein ID,the color,accordin

47、g to standard color calibrator to infer each dye the proportion to the dye mix,to represent the relative amount of the same kind of protein among different samples.64博學(xué)至精博學(xué)至精 明德至善明德至善蛋白質(zhì)組學(xué)proteomicswxj課件650C x 30 minGE(2004)2-D ElectrophoresisLysine Labeling(minimal labeling)In practice 400 pmol of

48、dye is added to 50ug of protein.In this way only 3-5%of the proteins will receive a tag(95-97%remain unlabeled)1.Labeling reaction:no IPG buffer,no reductant,pH 8.5,37,30 min with dye,the epsilon-amino side group of lysine is labeled with dye.博學(xué)至精博學(xué)至精 明德至善明德至善蛋白質(zhì)組學(xué)proteomicswxj課件66Cysteine Labeling(

49、saturation labeling)The high sensitivity,down to 1000 human cells(around 2.5 ug protein)could provide good 2-DE 1.Labeling reaction:no IPG buffer;TCEP reductant pH 8.0,37,1h;dye added pH 8.0,37 30 min;the thio group of cysteine labeled with dyes(Cy3 or Cy5).博學(xué)至精博學(xué)至精 明德至善明德至善蛋白質(zhì)組學(xué)proteomicswxj課件67Wor

50、kflow for 2-DE of Proteins Labeled with CyDyes博學(xué)至精博學(xué)至精 明德至善明德至善蛋白質(zhì)組學(xué)proteomicswxj課件68Workflow for DIGE of Proteins Labeled with CyDyesGE(2004)2-D Electrophoresis博學(xué)至精博學(xué)至精 明德至善明德至善蛋白質(zhì)組學(xué)proteomicswxj課件69Proteins Labeled with CyDyesMix Labeled Proteins 2-DELaser Scanner with Different WavelengthsIndivid

51、ual&Overlap Image Analysis(Protein Spot Location&Color)Identification of Protein ID&Abundance1st IEF(pI)2nd SDS-PAGE(Mw)博學(xué)至精博學(xué)至精 明德至善明德至善蛋白質(zhì)組學(xué)proteomicswxj課件Example for DIGE Images Scanned with Difference WavelengthProteomics in Practice p6970博學(xué)至精博學(xué)至精 明德至善明德至善蛋白質(zhì)組學(xué)proteomicswxj課件2-DE 凝膠蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的檢測(cè)凝膠蛋白質(zhì)

52、斑點(diǎn)的檢測(cè)n圖像掃描和分析圖像掃描和分析Image Scanner II博學(xué)至精博學(xué)至精 明德至善明德至善蛋白質(zhì)組學(xué)proteomicswxj課件2-DE 凝膠蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的檢測(cè)凝膠蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的檢測(cè)n全自動(dòng)斑點(diǎn)切取系統(tǒng)（全自動(dòng)斑點(diǎn)切取系統(tǒng)（Ettan Spot Picker）博學(xué)至精博學(xué)至精 明德至善明德至善蛋白質(zhì)組學(xué)proteomicswxj課件v質(zhì)譜原理：質(zhì)譜原理：樣本分子離子化后,根據(jù)不同離子間質(zhì)荷比(m/e)差異,分離樣本,確定分子量2-DE 凝膠蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的檢測(cè)凝膠蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的檢測(cè)博學(xué)至精博學(xué)至精 明德至善明德至善蛋白質(zhì)組學(xué)proteomicswxj課件Principle for Ma

53、ss Spectrometry74Schematic of Quadrupole TOF Hybrid AnalyzerWestermeier(2008)Proteomics in Practice博學(xué)至精博學(xué)至精 明德至善明德至善蛋白質(zhì)組學(xué)proteomicswxj課件電噴霧質(zhì)譜電噴霧質(zhì)譜博學(xué)至精博學(xué)至精 明德至善明德至善蛋白質(zhì)組學(xué)proteomicswxj課件n樣品溶于固定的底樣品溶于固定的底物中形成晶體，用物中形成晶體，用激光脈沖使其離子激光脈沖使其離子化化，離子被加速后，離子被加速后通過飛行管時(shí)分離，通過飛行管時(shí)分離，所有離子均可被檢所有離子均可被檢測(cè)，常用來測(cè)測(cè)，常用來測(cè)蛋白蛋白質(zhì)質(zhì)

54、、多肽、核酸和多肽、核酸和多糖等生物大分子多糖等生物大分子MALDI-TOF MS博學(xué)至精博學(xué)至精 明德至善明德至善蛋白質(zhì)組學(xué)proteomicswxj課件n通過質(zhì)譜分析，可以獲得分析樣品的通過質(zhì)譜分析，可以獲得分析樣品的分子量、分子分子量、分子式、分子中同位素構(gòu)成和分子結(jié)構(gòu)式、分子中同位素構(gòu)成和分子結(jié)構(gòu)等多方面的信息等多方面的信息SARS病毒病毒N蛋白整體分子量蛋白整體分子量 博學(xué)至精博學(xué)至精 明德至善明德至善蛋白質(zhì)組學(xué)proteomicswxj課件n蛋白質(zhì)經(jīng)過酶解成肽段后，獲得所有肽段的蛋白質(zhì)經(jīng)過酶解成肽段后，獲得所有肽段的分子質(zhì)量，形成一個(gè)特異的肽質(zhì)量指紋圖譜分子質(zhì)量，形成一個(gè)特異的肽質(zhì)

55、量指紋圖譜（peptide mass fingerprinting，PMF），通），通過數(shù)據(jù)庫搜索與比對(duì)，便可確定待分析蛋白過數(shù)據(jù)庫搜索與比對(duì)，便可確定待分析蛋白質(zhì)分子的性質(zhì)質(zhì)分子的性質(zhì)。Peptide Mass Fingerprinting(PMF)博學(xué)至精博學(xué)至精 明德至善明德至善蛋白質(zhì)組學(xué)proteomicswxj課件Peptide Mass Fingerprinting(PMF)博學(xué)至精博學(xué)至精 明德至善明德至善蛋白質(zhì)組學(xué)proteomicswxj課件Peptide Mass Fingerprinting(PMF)博學(xué)至精博學(xué)至精 明德至善明德至善蛋白質(zhì)組學(xué)proteomicswxj課

56、件n用用PMF方法未能鑒定的蛋白質(zhì)可通過質(zhì)方法未能鑒定的蛋白質(zhì)可通過質(zhì)譜技術(shù)獲得該蛋白質(zhì)一段或數(shù)段多肽的串譜技術(shù)獲得該蛋白質(zhì)一段或數(shù)段多肽的串連質(zhì)譜信息（氨基酸序列）并通過數(shù)據(jù)庫連質(zhì)譜信息（氨基酸序列）并通過數(shù)據(jù)庫檢索來鑒定該蛋白質(zhì)。檢索來鑒定該蛋白質(zhì)。n混合蛋白質(zhì)酶解后的多肽混合物直接通過混合蛋白質(zhì)酶解后的多肽混合物直接通過（多維）液相色譜分離，然后進(jìn)入質(zhì)譜進(jìn)（多維）液相色譜分離，然后進(jìn)入質(zhì)譜進(jìn)行分析。行分析。用串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS）鑒定蛋白質(zhì)博學(xué)至精博學(xué)至精 明德至善明德至善蛋白質(zhì)組學(xué)proteomicswxj課件用串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS）鑒定蛋白質(zhì)博學(xué)至精博學(xué)至精 明德至善明德至善蛋白質(zhì)組

57、學(xué)proteomicswxj課件多肽氨基酸序列分析多肽氨基酸序列分析串聯(lián)質(zhì)譜（串聯(lián)質(zhì)譜（Tandem-MS）,第一級(jí)質(zhì)譜得到肽的分子離子第一級(jí)質(zhì)譜得到肽的分子離子,選取目標(biāo)肽的離選取目標(biāo)肽的離子作為母離子，與惰性氣體碰撞，使肽鏈中的肽鍵斷裂，形成一系列離子，子作為母離子，與惰性氣體碰撞，使肽鏈中的肽鍵斷裂，形成一系列離子，即即N端碎片離子系列（端碎片離子系列（B系列）和系列）和C端碎片離子系列（端碎片離子系列（Y系列），將這些碎系列），將這些碎片離子系列綜合分析，可得出肽段的氨基酸序列。片離子系列綜合分析，可得出肽段的氨基酸序列?！皃rotein ladder sequencing”的方法，通

58、過對(duì)的方法，通過對(duì)Edman降解法的修改，產(chǎn)降解法的修改，產(chǎn)生一系列截去生一系列截去N端殘基的肽段，用端殘基的肽段，用MALDI-MS測(cè)得這些肽段的質(zhì)量，從而測(cè)得這些肽段的質(zhì)量，從而推測(cè)推測(cè)N端序列。端序列。博學(xué)至精博學(xué)至精 明德至善明德至善蛋白質(zhì)組學(xué)proteomicswxj課件84The protonated total peptide mass is 1410.6.The peptide to be ionized into N-terminal ions(b-ions)and C-terminal ions(y-ions).The alignment of these ions of

59、the peptide from small to large according to their m/z,a unique mass spectrum for the peptide.The signal intensity(the height)of each ion represents the abundance of the fragment ion in system.Contrast of b-ions to y-ions could infer the peptide sequence.多肽氨基酸序列分析多肽氨基酸序列分析博學(xué)至精博學(xué)至精 明德至善明德至善蛋白質(zhì)組學(xué)prote

60、omicswxj課件多肽氨基酸序列分析多肽氨基酸序列分析博學(xué)至精博學(xué)至精 明德至善明德至善蛋白質(zhì)組學(xué)proteomicswxj課件Isotope Labeling Protein Samples via Metabolism Campbell(2002)Discovering p189 86Different Isotopes to label different samples via metabolism.Combine the samples at a ratio of one to one from diff sources and to subject to separation,a

61、nd digestion.Analysis by MS to produce characteristic mass spectrum (1)at every m/z point,two peaks always occurred in couple,representing the same molecule with diff mass isotopes:the front with light isotope and the following with heavy one.(2)at every m/z point,the ratio of two peaks to represent

62、 the same molecule relative abundance from diff sources.博學(xué)至精博學(xué)至精 明德至善明德至善蛋白質(zhì)組學(xué)proteomicswxj課件Isotope Tag ICAT for Labeling of Protein Samples in vitro 87ICAT consists of three parts(i)biotin affinity tag,bind reversibly to avidin(ii)a linker,contain 8 stable isotopes(iii)thiol group,bind to cysteine

63、 of protein In ICAT molecule,if X groups present with H(=1),the ICAT is the light isotope tag.If X groups present with D(deuterium=2),the ICAT is the heavy isotope tag.The mass difference between H and D in ICAT could be discriminated by MS.博學(xué)至精博學(xué)至精 明德至善明德至善蛋白質(zhì)組學(xué)proteomicswxj課件88Workflow of Protein

64、Tagged with ICAT for LC-MS Campbell(2002)Discovering 博學(xué)至精博學(xué)至精 明德至善明德至善蛋白質(zhì)組學(xué)proteomicswxj課件Proteins Labeled with ICAT in vitro,Analyzed by MS Campbell(2002)Discovering p19189In vitro proteins from diff sources to be labeled with different ICAT,light and heavy mass.Combine the samples(the light with t

65、he heavy)and digest it.With affinity purification against ICAT to isolate protein fragments labeled with ICAT.The ICAT-label fragments to be analyzed by MS,similar to that of labeled with N14 and N15.At a m/z point,there are two mass peaks,the same molecule,from different sources,labeled with the li

66、ght and the heavy ICAT.The peak ratio represents the same molecule with relative abundance according to diff sources.博學(xué)至精博學(xué)至精 明德至善明德至善蛋白質(zhì)組學(xué)proteomicswxj課件90Quantification and Identification Proteins by ICATCampbell(2002)Discovering 蛋白質(zhì)組學(xué)proteomicswxj課件蛋白質(zhì)功能研究技術(shù)蛋白質(zhì)功能研究技術(shù)功能蛋白質(zhì)組學(xué)功能蛋白質(zhì)組學(xué)博學(xué)至精博學(xué)至精 明德至善明德至善蛋白質(zhì)組學(xué)proteomicswxj課件Techniques for Study of Protein-Protein InteractionsProtein MicroarrayPull down Immunoprecipitation（Co-IP）&Western BlottingY2H System(yeast two-hybrid system)Fluorescence Resonanc