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1、實驗六 TPPA檢測梅毒螺旋體抗體和 TRUST檢測反應(yīng)素 醫(yī)學(xué)檢驗系 臨床微生物免疫檢驗教研室 何應(yīng)中 一、目的及要求 掌握：凝集法的基本原理和TPPA檢測梅毒螺旋體抗體的 實驗原理。 熟悉：TRUST檢測反應(yīng)素的原理，TPPA的操作方法和結(jié) 果判定。 了解：TRUST的操作及結(jié)果判斷，TPPA和TRUST的注意事 項及臨床意義。 二、基本概念 1.直接凝集反應(yīng)：細(xì)菌、螺旋體、紅細(xì)胞等顆?？乖?在適當(dāng)電解質(zhì)參與下可直接與相應(yīng)抗體結(jié)合出現(xiàn)肉眼 可見的凝集現(xiàn)象。 2.間接凝集反應(yīng)：先將可溶性抗原(或抗體)吸附于適當(dāng) 大小的顆粒性載體表面，然后與相應(yīng)抗體(或抗原)反 應(yīng)，在適當(dāng)電解質(zhì)參與下，出現(xiàn)

2、特異性凝集現(xiàn)象。 基本概念 凝集反應(yīng)是一種定性檢測方法，根據(jù)凝集現(xiàn)象 出現(xiàn)與否判定結(jié)果是否陽性或陰性，但也可做半定量 檢測，即將待測樣本作一系列倍比稀釋后進(jìn)行反應(yīng)， 以出現(xiàn)凝集反應(yīng)的最高稀釋度為效價。 基本概念 梅毒螺旋體(treponema pallidum,TP)引起全身 性慢性傳染病-梅毒，主要通過性交傳染。TP進(jìn)入人 體后，可產(chǎn)生兩種抗體，一種是非特異性抗心擬脂抗 體(又稱反應(yīng)素)，可用牛心擬脂檢測，稱非梅毒螺旋 體抗原血清反應(yīng)；另一種是抗梅毒螺旋體抗體，可用 梅毒螺旋體檢測出來，稱梅毒螺旋體抗原血清反應(yīng)。 本次實驗以梅毒螺旋體被動顆粒凝集試驗 (treponema pallidum

3、passive particle agglutination test，TPPA)檢測梅毒螺旋體抗體和 梅毒甲苯胺紅不加熱血清試驗(syphilis toluidine red untreated serum test，TRUST)檢測血清中的反 應(yīng)素。 三、梅毒螺旋體被動顆粒凝集試驗 (treponema pallidum passive particle agglutination test，TPPA)檢測梅毒螺旋 體抗體 （一）實驗原理 TPPA是將梅毒Treponema Pallidum(Nicho1s株) 的精制菌體成分包被在人工載體明膠粒子上。這種 致敏粒子和樣品中的梅毒螺旋體(T

4、P)抗體進(jìn)行反應(yīng)發(fā) 生凝集，產(chǎn)生粒子凝集反應(yīng)(Particle Agglutination Test；PA法)，由此可以檢測出血清或血漿中的梅毒 螺旋體(TP)抗體，并且可用來測定抗體效價。 （二）試劑和器材 1. 梅毒螺旋體抗體診斷試劑(凝集法) 包括溶解液、 血清稀釋液、致敏明膠粒子(凍干粉)、未致敏粒子( 凍干粉)、陽性對照血清等，有商品供應(yīng)。 2. 待測血清 臨床篩選獲得。 3. 器材 U型微量反應(yīng)板、可調(diào)移液器(10100l, 1001000l)、加樣吸嘴、刻度滴管、25l微量滴 管、平板混合器、判定用觀察板等。 （三）操作方法 11致敏粒子和1未致敏粒子的配制：分別加入一 定量的溶

5、解液溶解混勻即可。請在使用前30分鐘于室 溫(1530)下進(jìn)行配制。 2用移液器加入血清稀釋液100l于U型微量反應(yīng)板第 1孔中，從第2孔至第6孔各加入25l。 操作方法 3用移液器取樣本25l至第1孔中混勻，然后用移液 器從第1孔吸取25l于第2孔中混勻，再從第2孔中吸 取25l于第3孔中依次類推，以2N的方式從第1 孔稀釋至第6孔。 4用試劑盒中提供的滴管或移液器在第3孔中滴入1滴 (25l)未致敏粒子，從第4孔至第6孔各加入1滴 (25l)致敏粒子。 操作方法 5用平板混合器(或用手輕輕撞擊敲動)以不會導(dǎo)致微 量反應(yīng)板孔內(nèi)容物濺出的強(qiáng)度混合30秒鐘，加蓋后于 室溫(1530)下水平靜置2

6、小時后或次日，在觀察 鏡上記錄并觀察其反應(yīng)圖像，或者利用免疫稀釋判定 裝置進(jìn)行測定。見表3。 操作方法 表3 凝集法操作步驟 Well No. 1 2 3 4 5 6 血清稀釋液(ul) 100 25 25 25 25 25 待測血清(ul) 25 25 25 25 25 25 25 未致敏粒子(ul) 25 致敏粒子(ul) 25 25 25 最終稀釋倍數(shù) 1:40 1:80 1:160 1:320 混勻，加蓋后置室溫(1530)水平靜置2小時或過夜，觀察 反應(yīng)判定結(jié)果 （四）結(jié)果判斷 1.反應(yīng)圖像判定 在判定用觀測板上靜置微量反應(yīng)板，觀察 粒子的反應(yīng)圖像。將反應(yīng)圖像與介質(zhì)對照圖像 進(jìn)行比較

7、，并參照表4進(jìn)行判斷。 表4 凝集法反應(yīng)圖像判定 反應(yīng)圖像 判定 粒子成紐扣狀聚集,呈現(xiàn)外周邊緣均勻且平滑的圓形 () 粒子形成小環(huán)狀,呈現(xiàn)出外周邊緣均勻且平滑的圓形 () 粒子環(huán)明顯變大,外周邊緣不均勻且雜亂凝集在周圍 () 產(chǎn)生均一的凝集,凝集粒子在底部整體上呈膜狀延展 (+) 結(jié)果判斷 陽性：未致敏粒子最終稀釋倍數(shù)1:40的反應(yīng)圖像判定為 ()，致敏粒子最終稀釋倍數(shù)1:80以上的反應(yīng)圖 像判定為()，即最終判定為陽性，并將顯示反 應(yīng)圖像為()的最高稀釋倍數(shù)作為抗體效價。 陰性：無論未致敏粒子呈現(xiàn)何種反應(yīng)圖像，只要致敏粒 子最終稀釋倍數(shù)1:80的反應(yīng)圖像顯示為()時， 最終判定為陰性。 結(jié)

8、果判斷 2結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 可疑：未致敏粒子最終稀釋倍數(shù)1:40的反應(yīng)圖像判定為 ()且致敏粒子最終稀釋倍數(shù)l:80的反應(yīng)圖像判 定為()時，最終判定為可疑。 注意！通過本試劑判定為抗體陽性或可疑的，經(jīng)過 一段時間再進(jìn)行復(fù)查，并與其他檢查結(jié)果和臨床 癥狀結(jié)合起來加以綜合判斷。 結(jié)果判斷 （五）注意事項 1.致敏粒子及未致敏粒子在使用前均應(yīng)充分混勻。 2.試驗在滴加致敏粒子后反應(yīng)板中液體須充分混勻后才 能靜置。 3.反應(yīng)靜置過程中，反應(yīng)板一定要加蓋并禁止振搖。 4.用本試劑判定結(jié)果為可疑時，請使用其他檢查方法 (FTA-ABS法等)。 5.本試劑用來測定樣品中的梅毒(TP)抗體效價，而不是 直接用來

9、測定TP。在判定為抗體陽性的情況下，請結(jié) 合其他檢查結(jié)果及臨床癥狀進(jìn)行綜合判斷。 6.應(yīng)注意血清凝集法免疫反應(yīng)中可能發(fā)生的前帶現(xiàn)象。 注意事項 7.TP感染初期，有可能不產(chǎn)生抗體，或產(chǎn)生抗體但數(shù)量 很少的情況。如果已被懷疑為感染時，即使本試劑的 判定結(jié)果為陰性，也要經(jīng)過一段時間再進(jìn)行檢查并與 其他檢查(使用梅毒脂質(zhì)抗原進(jìn)行檢查，F(xiàn)TA-ABS試驗 等)結(jié)果和臨床癥狀結(jié)合起來加以綜合判斷。 注意事項 8服用含有免疫球蛋白血液制劑的患者樣品，有可能 因服用制劑而呈陽性反應(yīng)，應(yīng)注意做出準(zhǔn)確判定。 9待測樣品可能存在HBV，HCV，HIV等，因此對待測樣 品及使用過的器具應(yīng)按二級實驗室生物安全處理(用

10、 次氯酸鈉浸泡和121高壓蒸汽滅菌l小時以上)。 注意事項 10.本試劑的溶解液、血清稀釋液和陽性對照血清含有 疊氮鈉防腐劑。故在廢棄時要用大量水沖洗，以避免 生成具有爆炸性的金屬疊氮。 11.若發(fā)生試劑誤濺入口中或眼里，應(yīng)立即用大量清水 沖洗，必要時到醫(yī)院就診。 注意事項 四、梅毒甲苯胺紅不加熱血清試驗 (TRUST)檢測反應(yīng)素 （一）實驗原理 用牛心擬脂抗原吸附于特制甲苯胺紅上制 成致敏粒子，當(dāng)這種致敏粒子與樣本血清作用 時，若樣本中含有抗心擬脂抗體(反應(yīng)素)結(jié)合 ，形成肉眼可見的紅色凝集反應(yīng)。 （二）試劑和器材 1.梅毒甲苯胺紅不加熱血清試驗診斷試劑(TRUST) 包 括TRUST抗原懸

11、液、陰陽性對照血清、試驗專用卡片 、專用滴管及針頭。有商品供應(yīng)。 2.0.9生理鹽水。 3.待測血清 臨床篩選獲得。 4.器材 可調(diào)移液器(10100l)、加樣吸嘴、冰箱等 。 （三）操作方法 1定性試驗 (1)分別吸取梅毒陽性對照、陰性對照和待檢血清或血 槳(不需滅活)50l均勻鋪加于紙卡的三個圓圈中。 (2)用專用滴管及針頭垂直分別滴加TRUST試劑1滴于上 述血清中。 (3)按100r/min搖動8min，肉眼觀察結(jié)果。 操作方法 2定量試驗 將待檢血清用生理鹽水作倍比稀釋，然后 按上述定性方法進(jìn)行試驗，以呈現(xiàn)明顯凝集反 應(yīng)的最高稀釋度作為該血清的凝集效價。 （四）結(jié)果判斷 1.陽性反應(yīng)

12、(+)：可見中等或較大的紅色凝聚 物。 2.弱陽性反應(yīng)(+)：可見較小的紅色凝聚物。 3.陰性反應(yīng)()：可見均勻的抗原顆粒而無凝聚物。 （五）注意事項 1.本試驗在2329條件下進(jìn)行。 2.TRUST試劑使用前應(yīng)充分搖勻。 3.本試驗系非特異性反應(yīng)，需結(jié)合臨床進(jìn)行綜合分析， 必要時需作梅毒螺旋體抗體特異性試驗。 五、實驗討論與思考題 凝集反應(yīng)只有在抗原抗體比例適當(dāng)時，才能出現(xiàn) 肉眼可見的反應(yīng)。一般情況下，隨著血清濃度的逐漸 稀釋，凝集反應(yīng)越來越弱，但在抗體濃度過高時，反 而無凝集現(xiàn)象出現(xiàn)，此為前帶現(xiàn)象。出現(xiàn)該情況時， 須加大抗體稀釋倍數(shù)重新試驗。 實驗方法學(xué)評價：由于抗原抗體反應(yīng)的血清學(xué) 試驗

13、方法檢測靈敏度具有一定的局限性，所以本試劑 檢測結(jié)果只能提示血清或血漿中有無TP抗體存在，而 不能作為臨床診斷的唯一標(biāo)準(zhǔn)。TP抗體檢測陰性的 樣品并不能排除梅毒感染的可能。 實驗討論與思考題 通過本試劑判定為TP抗體陽性或可疑時，需經(jīng)過一 段時間再進(jìn)行復(fù)查，并與其他檢查結(jié)果和臨床癥狀結(jié)合 起來加以綜合判斷。 1.TRUST和TPPA是否是特異性實驗？為什么？ 2.TPPA陽性可以確診Treponema Pallidum嗎？TPPA陰性 可以排除Treponema Pallidum診斷嗎？為什么？ 實驗討論與思考題 實驗討論與思考題 3.直接凝集反應(yīng)和間接凝集反應(yīng)的概念是什么？ 4.何謂前帶現(xiàn)象？ 5.如何判定TPPA的結(jié)果？ 6.TPPA的注意事項是什么？ 7.Treponema Pallidum進(jìn)入人體后可產(chǎn)生哪幾種抗體？ 特異性如何？ 下次課預(yù)習(xí)內(nèi)容 實驗三 設(shè)計性實驗 設(shè)計性實驗的開題報告和技術(shù)路線。