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1、實驗五免疫酶技術(shù)及其應(yīng)用ELISA,一、實驗?zāi)康?了解和掌握免疫酶技術(shù)的測定原理。掌握酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)的操作步驟，學(xué)會利用競爭ELISA的方法，定量測定抗體或抗原。了解免疫酶技術(shù)在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究的重要意義及應(yīng)用價值。,二、實驗原理,免疫標記技術(shù)（immunolabellingtechnique）:是指用熒光素、放射性同位素、酶、發(fā)光劑或電子致密物質(zhì)等作為示蹤劑，標記抗體或抗原進行的抗原抗體反應(yīng)。特點：高度靈敏、特異、快速，定性、定量、定位分類：免疫酶技術(shù)、免疫熒光技術(shù)、放射免疫技術(shù)、免疫電鏡技術(shù)、免疫膠體金技術(shù)和發(fā)光免疫測定。,免疫酶技術(shù)(enzymeimmunoassay)：是將抗原和

2、抗體的特異性免疫反應(yīng)與酶的催化反應(yīng)相結(jié)合而建立的一種免疫檢測技術(shù)。就是利用酶標記抗體或抗原，以檢測相應(yīng)抗原或抗體的一種免疫學(xué)標記技術(shù)。,酶聯(lián)免疫吸附試驗ELISA（enzymelinkedimmunosorbentassay）是一類常用的免疫酶技術(shù)。是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面，使抗原抗體反應(yīng)在固相表面進行。常用的酶：辣根過氧化物酶(HRP)堿性磷酸酶（AP）。,ELISA檢測抗原,Ag+Ab*Ag-Ab*,ELISA檢測抗體,Ab+Ag*Ab-Ag*,ELISA檢測抗體,Ag+Ab1Ag-Ab1Ag-Ab1+Ab2*Ag-Ab1-Ab2*,競爭ELISA檢測抗原,固定OD值,實驗材

3、料：羊抗人血清白蛋白抗體（一抗）已知含量的人血清白蛋白（作標準曲線）待檢人血清白蛋白辣根過氧化物酶標記的驢抗羊抗體（二抗）包被液CBS：PH9.6，0.05mol/L碳酸鹽緩沖液洗板液或稀釋液：PH7.4，0.01mol/LPBS底物溶液：OPD-H2O2終止液：2mol/LH2S04酶標反應(yīng)板（一條/人）,三、操作步驟,包被抗原抗原用包被液（CBS）稀釋至合適濃度，加入到酶標板中，100l/孔，放入濕盒中，4過夜。,次日，用洗板液洗板3次（將洗板液加入每孔，1min后傾去），以洗去未包被的游離抗原。,抗原100ul/孔,濕盒中，4過夜,酶標板,抗原與抗體的預(yù)孵育制作標準曲線：在稀釋板中，用P

4、BS倍比稀釋標準抗原，每種濃度的抗原最終為50l，分別在各抗原孔中加入250l一定濃度的抗體，放入37恒溫培養(yǎng)箱中30min。待測抗原：取50l未知濃度的抗原按照同上操作。,50ul,稀釋板,3.與固相抗原的競爭結(jié)合取稀釋板中預(yù)孵育的抗原抗體混合液100l，加入酶標板的抗原孔中，放入37恒溫培養(yǎng)箱中60min。洗板3次。,100ul,稀釋板,酶標板,37，60min,洗板3次,4.酶標二抗的結(jié)合酶標抗體用稀釋液稀釋至工作濃度后，加入每孔中，100ul/孔，置濕盒中放3730min。洗板3次。5.加入底物顯色液（用前再配制，并置棕色瓶內(nèi)）每孔加入底物顯色液，100ul/孔，濕盒中37保溫一定時間。6.終止反應(yīng)待出現(xiàn)明顯顏色反應(yīng)（或一定時間）后，加入終止液，50ul/孔以終止反應(yīng)。7.結(jié)果測定用酶標儀在492nm波長下測定OD值。以標準抗原的濃度為橫坐標，相應(yīng)的OD值為縱坐標繪制標準曲線，計算未知抗原的濃度。,四、思考題,在定量測定抗原時，直接ELISA與競爭ELISA有何區(qū)別？從理論上分析一下各自的優(yōu)缺點。在實際操作中，你認為有哪些因素可以影響定量檢測的結(jié)果？（操作中應(yīng)注意的問題）實驗設(shè)計題：如何用競爭ELISA來定量檢測抗體？,