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1、會計學1高中生物基因工程的基本操作程序高中生物基因工程的基本操作程序 新人新人教選修教選修原核細胞的基因結(jié)構(gòu)原核細胞的基因結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游編碼區(qū)下游 與與RNARNA聚合酶結(jié)合位點聚合酶結(jié)合位點啟動子啟動子終止子終止子編碼區(qū)編碼區(qū)： 能轉(zhuǎn)錄，編碼蛋白質(zhì)能轉(zhuǎn)錄，編碼蛋白質(zhì)非編碼區(qū)非編碼區(qū)：不編碼蛋白質(zhì)不編碼蛋白質(zhì), ,能調(diào)控遺傳信息表達能調(diào)控遺傳信息表達第1頁/共46頁真核細胞的基因結(jié)構(gòu)真核細胞的基因結(jié)構(gòu)編碼編碼區(qū)區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)啟動子啟動子終止子終止子編碼區(qū)上游編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游編碼區(qū)下游 內(nèi)含子內(nèi)含子 外顯

2、子外顯子 與與RNARNA聚合聚合酶結(jié)合位點酶結(jié)合位點編碼區(qū)編碼區(qū)：非編碼區(qū)非編碼區(qū)：外顯子外顯子： 內(nèi)含子內(nèi)含子： 能編碼蛋白質(zhì)的序列能編碼蛋白質(zhì)的序列不能編碼蛋白質(zhì)的序列不能編碼蛋白質(zhì)的序列第2頁/共46頁非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)RNA聚合酶聚合酶結(jié)合位點結(jié)合位點外顯子外顯子內(nèi)含子內(nèi)含子終止子終止子啟動子啟動子原原核核真真核核基因的結(jié)構(gòu)基因的結(jié)構(gòu)第3頁/共46頁原核細胞原核細胞真核細胞真核細胞不同點不同點編碼區(qū)是編碼區(qū)是_的的編碼區(qū)是間隔的、編碼區(qū)是間隔的、_的的相同點相同點都由能夠編碼蛋白質(zhì)的都由能夠編碼蛋白質(zhì)的_和具和具有調(diào)控作用的有調(diào)控作用的_區(qū)組成的區(qū)組成的第4

3、頁/共46頁 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序第5頁/共46頁第6頁/共46頁 目的基因主要是指目的基因主要是指_編碼蛋白質(zhì)的基因編碼蛋白質(zhì)的基因供體生物細胞供體生物細胞取出取出DNADNA用限制酶剪用限制酶剪去多余部分去多余部分目的基因目的基因即：將需要的基因從供體生物細胞內(nèi)提取出來即：將需要的基因從供體生物細胞內(nèi)提取出來目前被廣泛提取使目前被廣泛提取使用的目的基因有：蘇用的目的基因有：蘇云金桿菌抗蟲基因、云金桿菌抗蟲基因、植物抗病基因植物抗病基因人胰島人胰島素基因等。也可以是素基因等。也可以是一些具有調(diào)控作用的一些具有調(diào)控作用的因子因子第7頁/共46頁1.1.什么是基因文庫？什

4、么是基因文庫？2.2.怎樣從基因文庫中得到我們所需的目的基因？怎樣從基因文庫中得到我們所需的目的基因？種類：種類：基因組文庫：基因組文庫：部分基因文庫：部分基因文庫：( (如如cDNAcDNA文庫文庫) )基因的核苷酸序列等基因的核苷酸序列等l利用利用PCRPCR技術(shù)擴增目的基因技術(shù)擴增目的基因l人工合成人工合成 含有一種生物的含有一種生物的全部全部基因基因含有一種生物的含有一種生物的部分部分基因基因根據(jù)基因的有關(guān)信息：如基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物根據(jù)基因的有關(guān)信息：如基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNAmRNA第8頁/共46頁1.1.用一定的用一定的_切割切割 質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個切質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個切 口，露出口，露

5、出_。2.2.用用_切斷目切斷目 的基因，使其產(chǎn)生的基因，使其產(chǎn)生_ _ _。 核心核心3.3.將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的_處，處， 再加入適量再加入適量_，形成了一個重組，形成了一個重組 DNADNA分子（重組質(zhì)粒）分子（重組質(zhì)粒）限制酶限制酶黏性末端黏性末端同一種限制酶同一種限制酶的黏性末端的黏性末端切口切口DNADNA連接酶連接酶相同相同( (二二) )基因表達載體的構(gòu)建基因表達載體的構(gòu)建第9頁/共46頁質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA分子分子限制酶處理限制酶處理一個切口一個切口兩個黏性末端兩個黏性末端兩個切口兩個切口獲得目的基因獲得目的基因DNADNA連接酶連接酶

6、重組重組DNADNA分子（重組質(zhì)粒）分子（重組質(zhì)粒） 核心核心同一種同一種( (二二) )基因表達載體的構(gòu)建基因表達載體的構(gòu)建4.4.過過程程: :第10頁/共46頁 科學家在培育抗蟲棉時，經(jīng)過了許多復(fù)雜的科學家在培育抗蟲棉時，經(jīng)過了許多復(fù)雜的過程和不懈的努力，才獲得成功。過程和不懈的努力，才獲得成功。 起初把蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因插入載體起初把蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因插入載體質(zhì)粒中，然后導(dǎo)入棉花的受精卵中，結(jié)果抗蟲基質(zhì)粒中，然后導(dǎo)入棉花的受精卵中，結(jié)果抗蟲基因在棉花體內(nèi)沒有表達。因在棉花體內(nèi)沒有表達。 然后在插入抗蟲基因的質(zhì)粒中插入啟動子然后在插入抗蟲基因的質(zhì)粒中插入啟動子( (抗蟲基因首

7、端抗蟲基因首端) )，導(dǎo)入棉花受精卵，長成的棉花，導(dǎo)入棉花受精卵，長成的棉花植株還是沒有抗蟲能力。科學家又在有啟動子、植株還是沒有抗蟲能力。科學家又在有啟動子、抗蟲基因的質(zhì)粒中插入終止子抗蟲基因的質(zhì)粒中插入終止子( (抗蟲基因末端抗蟲基因末端) )，導(dǎo)入棉花受精卵，結(jié)果成長的植株，有了抗蟲能導(dǎo)入棉花受精卵，結(jié)果成長的植株，有了抗蟲能力。力。 第11頁/共46頁目的：使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存目的：使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時使目在，并且可以遺傳給下一代，同時使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。的基因能夠表達和發(fā)揮作用。a、目的基因、目的基因b、啟動子、啟動子c、終止子

8、、終止子d、標記基因、標記基因第12頁/共46頁( (三三) )將目的基因?qū)胧荏w細胞將目的基因?qū)胧荏w細胞轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化目的基因進入目的基因進入_內(nèi)，并且在內(nèi)，并且在 受體細胞內(nèi)維持受體細胞內(nèi)維持_和和_的過程的過程受體細胞受體細胞穩(wěn)定穩(wěn)定表達表達第13頁/共46頁方法方法導(dǎo)入植物細胞導(dǎo)入植物細胞導(dǎo)入動物細胞導(dǎo)入動物細胞導(dǎo)入微生物細胞導(dǎo)入微生物細胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法基因槍法花粉管通道法花粉管通道法顯微注射法顯微注射法 感受態(tài)細胞吸收感受態(tài)細胞吸收DNADNA分子分子( (三三) )將目的基因?qū)胧荏w細胞將目的基因?qū)胧荏w細胞第14頁/共46頁( (四四) )目的基因的檢測與鑒定目的基

9、因的檢測與鑒定檢查是否成功檢查是否成功檢測檢測鑒定鑒定檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA DNA 上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNAmRNA檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等方法方法方法方法方法方法DNADNA分子雜交分子雜交分子雜交分子雜交抗原抗原- -抗體雜交抗體雜交第15頁/共46頁直接分離法直接分離法: :2. 構(gòu)建基因文庫構(gòu)建基因文庫第16頁/共46頁直接分離法直接分離法：供體細胞中的供體細胞中的DNADNA許多許多DNADN

10、A片段片段運載體運載體限制酶限制酶分別與分別與 載體連載體連接接受體細胞受體細胞分別分別 導(dǎo)入導(dǎo)入2. 構(gòu)建基因文庫構(gòu)建基因文庫第17頁/共46頁mRNA 反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄cDNA(互補互補DNA） DNA聚合酶聚合酶雙鏈雙鏈DNA反轉(zhuǎn)錄法：反轉(zhuǎn)錄法：2. 構(gòu)建基因文庫構(gòu)建基因文庫第18頁/共46頁第19頁/共46頁文庫類型文庫類型cDNAcDNA文庫文庫基因組文庫基因組文庫文庫大小文庫大小小小大大基因中基因中啟動子啟動子無無有有基因中基因中內(nèi)含子內(nèi)含子無無有有基因多少基因多少某種生物的部分基因某種生物的部分基因某種生物的全部基因某種生物的全部基因物種之間的基物種之間的基因交流因交流可以可以部分基

11、因可以部分基因可以說明說明基因文庫的組建過程就包含基因工程的基本操基因文庫的組建過程就包含基因工程的基本操作步驟作步驟。從基因文庫中獲取目的基因的優(yōu)點是。從基因文庫中獲取目的基因的優(yōu)點是操作簡便，缺點是工作量大，具有一定的盲目操作簡便，缺點是工作量大，具有一定的盲目性性. .第20頁/共46頁依據(jù)：目的基因的有關(guān)信息。依據(jù)：目的基因的有關(guān)信息。如：根據(jù)如：根據(jù)基因的核苷酸序列基因的核苷酸序列基因的功能、基因在染色體上的位置基因的功能、基因在染色體上的位置基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNAmRNA基因的表達產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性。基因的表達產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性。3如何從基因文庫中得到所需要的基因？如何從

12、基因文庫中得到所需要的基因？第21頁/共46頁原理:DNA雙鏈復(fù)制前提:要有一段已知目的基因的脫氧核苷酸序列，以便合成引物。第22頁/共46頁 概念：概念：PCRPCR全稱為全稱為_，是一項，是一項 在生物在生物_復(fù)制復(fù)制_的核酸合成技術(shù)的核酸合成技術(shù) 條件：條件：_、 _、_ _ 、 _._.前提條件：前提條件：原理：原理：_方式：以方式：以_方式擴增，即方式擴增，即_ _（n n為擴增為擴增循循 環(huán)的次數(shù)）環(huán)的次數(shù)）結(jié)果：結(jié)果：選修選修1 P1 P6060聚合酶鏈式反應(yīng)聚合酶鏈式反應(yīng)體外體外特定特定DNADNA片段片段DNADNA雙鏈復(fù)制雙鏈復(fù)制已知基因的核苷酸序列已知基因的核苷酸序列四種

13、脫氧核苷酸四種脫氧核苷酸一對引物一對引物DNADNA聚合酶聚合酶指數(shù)指數(shù)2 2n n使目的基因的片段在短時間內(nèi)成百萬倍地擴增使目的基因的片段在短時間內(nèi)成百萬倍地擴增利用利用PCRPCR技術(shù)擴增目的基因技術(shù)擴增目的基因第23頁/共46頁過程：過程：a a、DNADNA變性（變性（90-9590-95）：雙鏈）：雙鏈DNADNA模板模板 在熱作用下，在熱作用下，_斷裂，形成斷裂，形成_b b、退火（、退火（復(fù)性復(fù)性55-6555-65）：系統(tǒng)溫度降低，引）：系統(tǒng)溫度降低，引 物與物與DNADNA模板結(jié)合，形成局部模板結(jié)合，形成局部_。 c c、延伸（、延伸（70-7570-75）：在）：在TaqT

14、aq酶的作用下，酶的作用下，從從 引物的引物的55端端33端端延伸，合成與模板互補延伸，合成與模板互補 的的_ _。 氫鍵氫鍵單鏈單鏈DNADNA雙鏈雙鏈DNADNA鏈鏈第24頁/共46頁第25頁/共46頁利用利用PCRPCR技術(shù)擴增目的基因技術(shù)擴增目的基因第26頁/共46頁PCRPCR技術(shù)擴增過程技術(shù)擴增過程a a、DNADNA變性（變性（90-9590-95）：雙鏈）：雙鏈DNADNA模板模板 在熱作用下，在熱作用下， 斷裂，形成斷裂，形成_ _ b b、復(fù)性（、復(fù)性（55-6055-60）：系統(tǒng)溫度降低，引物）：系統(tǒng)溫度降低，引物 與與DNADNA模板結(jié)合，形成局部模板結(jié)合，形成局部_。

15、 c c、延伸（、延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶的作用酶的作用下，從引物的下，從引物的55端端33端延伸，合成與端延伸，合成與模板互補的模板互補的_。 氫鍵氫鍵單鏈單鏈DNADNA雙鏈雙鏈DNADNA鏈鏈第27頁/共46頁PCRPCR技術(shù)技術(shù)DNADNA復(fù)制復(fù)制過程過程DNADNA變性（變性（90909595）退火退火（復(fù)性（復(fù)性55556060）子鏈延伸子鏈延伸（70707575）重復(fù)循環(huán)重復(fù)循環(huán)DNADNA復(fù)制起始，復(fù)制起始，RNARNA引物形成引物形成DNADNA片段生成片段生成RNARNA引物水解引物水解完整的完整的DNADNA分子形成分子形成相同相同點點原則原則

16、堿基互補配對堿基互補配對條件條件模板、原料（模板、原料（dCTPdCTP、dATPdATP、dGTPdGTP、dTTPdTTP）、能量、酶、引物等）、能量、酶、引物等不同不同點點解旋方解旋方式式氫鍵在高溫下斷氫鍵在高溫下斷裂，雙鏈全部解裂，雙鏈全部解開開解旋酶催化氫鍵逐步斷裂解旋酶催化氫鍵逐步斷裂場所場所體外體外主要在細胞核中主要在細胞核中引物引物DNADNARNARNA酶酶熱穩(wěn)定熱穩(wěn)定DNADNA聚合酶聚合酶（TaqTaq酶）酶）解旋酶、解旋酶、DNADNA聚合酶、聚合酶、DNADNA連接酶等連接酶等結(jié)果結(jié)果在短時間內(nèi)形成在短時間內(nèi)形成大量的大量的DNADNA片段片段形成完整的形成完整的DN

17、ADNA分子分子第28頁/共46頁第29頁/共46頁2.2.微生物作受體細胞原因：微生物作受體細胞原因：將目的基因?qū)胛⑸锛毎麑⒛康幕驅(qū)胛⑸锛毎?.3.轉(zhuǎn)化方法：轉(zhuǎn)化方法：大腸桿菌大腸桿菌繁殖快、多為單細胞、遺傳物質(zhì)相對少繁殖快、多為單細胞、遺傳物質(zhì)相對少處理細胞處理細胞細胞細胞表達載體與感受態(tài)細胞表達載體與感受態(tài)細胞混合混合 _細胞吸收細胞吸收DNADNA分子。分子。CaCa2+2+感受態(tài)感受態(tài)感受感受態(tài)態(tài)1.1.常用菌：常用菌：第30頁/共46頁 目的基因插入目的基因插入TiTi質(zhì)粒的質(zhì)粒的T-DNAT-DNA上上 農(nóng)桿菌農(nóng)桿菌 導(dǎo)入植物細胞導(dǎo)入植物細胞 整合到受體細胞的染色體上整

18、合到受體細胞的染色體上 目的基因的遺傳特性得以維持穩(wěn)定和表達目的基因的遺傳特性得以維持穩(wěn)定和表達 1.1.農(nóng)桿菌特點：農(nóng)桿菌特點：易感染雙子葉植物和裸子植易感染雙子葉植物和裸子植物。物。TiTi質(zhì)粒的質(zhì)粒的T-DNAT-DNA可轉(zhuǎn)移至受體細胞的染色體上可轉(zhuǎn)移至受體細胞的染色體上2.轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化化第31頁/共46頁第32頁/共46頁第33頁/共46頁細胞細胞類型類型常用方法常用方法 受體細受體細胞胞轉(zhuǎn)化過程轉(zhuǎn)化過程植物植物細胞細胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法化法體細胞體細胞將目的基因插入將目的基因插入TiTi質(zhì)粒的質(zhì)粒的T-DNAT-DNA上上轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌導(dǎo)入植物細胞導(dǎo)入植物細胞整整合到受體細胞的合到

19、受體細胞的DNADNA動物動物細胞細胞顯微注射顯微注射技術(shù)技術(shù)受精卵受精卵將含有目的基因的表達載體提純將含有目的基因的表達載體提純?nèi)÷讶÷咽芫咽芫扬@微注射顯微注射早期胚早期胚胎培養(yǎng)胎培養(yǎng)胚胎移植胚胎移植發(fā)育成為具有發(fā)育成為具有新性狀的動物新性狀的動物微生微生物細物細胞胞CaCa2+2+處理處理法法原核細原核細胞胞用用CaCa2+2+處理細胞處理細胞感受態(tài)細胞感受態(tài)細胞重重組表達載體組表達載體DNADNA分子與感受態(tài)細胞分子與感受態(tài)細胞混合混合感受態(tài)細胞吸收感受態(tài)細胞吸收DNADNA分子分子第34頁/共46頁檢測檢測步驟步驟目的目的方法方法原理原理工具工具現(xiàn)象現(xiàn)象1 1DNADNA分子分子雜

20、交技術(shù)雜交技術(shù)堿基互堿基互補配對補配對放射性同位素作放射性同位素作標記的含目的基標記的含目的基因的因的DNADNA片段片段雜交帶雜交帶2 2檢測目的基因是檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了否轉(zhuǎn)錄出了mRNAmRNADNADNA分子分子雜交技術(shù)雜交技術(shù)堿基互堿基互補配對補配對放射性同位素作放射性同位素作標記的含目的基標記的含目的基因的因的DNADNA片段片段雜交帶雜交帶3 3檢測目的基因是檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)否翻譯成蛋白質(zhì)抗原抗原- -抗抗體雜交體雜交抗體的抗體的專一性專一性特定抗體特定抗體雜交帶雜交帶( (陽陽性反應(yīng)性反應(yīng)) )第35頁/共46頁第36頁/共46頁第37頁/共46頁第38頁/共4

21、6頁第39頁/共46頁第40頁/共46頁第41頁/共46頁第42頁/共46頁2 2、下列屬于獲取目的基因的方法的是、下列屬于獲取目的基因的方法的是( )( )利用利用mRNAmRNA反轉(zhuǎn)錄形成反轉(zhuǎn)錄形成從基因組文庫中提取從基因組文庫中提取從受體細胞中提取從受體細胞中提取 利用利用PCRPCR技術(shù)技術(shù) 利用利用DNADNA轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄 人工合成人工合成A.A. B. B. C. C. D.D.1 1、 在基因工程中，把選出的目的基在基因工程中，把選出的目的基因（共因（共10001000個脫氧核苷酸對，其中腺嘌嶺個脫氧核苷酸對，其中腺嘌嶺脫氧核苷酸是脫氧核苷酸是460460個）放入個）放入DNADNA

22、擴增儀中擴擴增儀中擴增增4 4代，那么，在擴增儀中應(yīng)放入胞嘧啶代，那么，在擴增儀中應(yīng)放入胞嘧啶脫氧核苷酸的個數(shù)是（脫氧核苷酸的個數(shù)是（ ）個）個A. 540 B. 8100 C. 17280 D. 7560第43頁/共46頁3.細菌的質(zhì)粒分子帶有一個抗菌素抗性基因，該抗細菌的質(zhì)粒分子帶有一個抗菌素抗性基因，該抗性基因在基因工程中的主要作用是性基因在基因工程中的主要作用是 A提高受體細胞在自然環(huán)境中的耐藥性提高受體細胞在自然環(huán)境中的耐藥性 B B有利于對目的基因是否導(dǎo)入進行檢測有利于對目的基因是否導(dǎo)入進行檢測C C增加質(zhì)粒分子的分子量增加質(zhì)粒分子的分子量D D便于與外源基因連接便于與外源基因連接4.4. 有關(guān)基因工程的敘述正確的是有關(guān)基因工程的敘述正確的是A A限制酶只在獲得目的基因時才用限制酶只在獲得目的基因時才用B B重組質(zhì)粒的形成是在細胞內(nèi)完成的重組質(zhì)粒的形成是在細胞內(nèi)完成的C C質(zhì)粒都可作為運載體質(zhì)粒都可作為運載體 D D蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可為合成目的基因提供資料蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可為合成目的基因提供資料第44頁/共46頁第45頁/共46頁